研究背景乙型肝炎病毒(HBV)感染是一种严重影响人类健康的全球性疾病。它可导致各种急、慢性疾病,包括致命的重型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等。目前治疗慢性乙型肝炎(CHB)的抗病毒药物主要有干扰素及核苷(酸)类似物两大类。核苷(酸)类似物进入体内后通过竞争掺入,取代病毒复制过程中延长聚合酶链所需的与之结构相似的核苷酸,由于核苷(酸)类似物缺乏3′端羟基而不能继续延伸DNA链,从而抑制病毒复制。但是由于核苷(酸)类似物对作为复制模板的共价闭合环状DNA(cccDNA)无作用,核苷(酸)类似物仅能抑制HBV复制而不能完全清除HBV,因此CHB患者需要长时间服用核苷(酸)类似物治疗以抑制病毒复制。然而长期服用核苷(酸)类似物有可能出现病毒变异而导致耐药问题。其耐药的基础是复制过程中,HBV需要利用自身的DNA聚合酶将前基因组RNA逆转录为DNA,由于HBV聚合酶没有校正活性,容易出现错配而导致突变。核苷(酸)类似物作用于HBV的聚合酶区,而聚合酶区基因突变可能导致某些特定部位的氨基酸被置换,使之与药物的结合力下降,从而出现药物敏感性降低和耐药。拉米夫定耐药的变异为HBV DNA聚合酶基因P区第739个核苷酸A突变为G,使第204位的蛋氨酸被缬氨酸替代(rtM204V),即YMDD突变为YVDD,且往往同时还伴有第180位的亮氨酸被蛋氨酸所置换(rtL180M)的变异。核苷(酸)类似物耐药为目前慢性乙型肝炎抗病毒治疗中所面临的主要难题之一,因此有必要建立核苷(酸)类似物耐药模型用于抗病毒药物的开发、筛选、耐药机理的研究。由于HBV感染有高度的种属和组织特异性,仅感染人和猩猩,而猩猩价格昂贵,来源困难,故动物模型缺乏。在HBV相关研究中,多使用转基因动物模型和体外细胞模型。转基因动物模型由于动物本身的免疫状态及遗传背景尚不十分明确,其使用受到限制。目前体外细胞培养模型主要有三大类:第一类是HBV直接感染细胞模型;第二类是不产生基因整合的瞬时转染细胞模型;第三类是HBV基因与细胞基因组基因整合并持续产生HBV颗粒的稳定表达细胞株。感染模型的细胞来源困难,难以长期培养,使用较少。瞬时转染细胞模型缺点仍为不能长期培养,同时受实验条件影响大。基于耐药研究、药物筛选及评价方面的考虑,细胞模型需要稳定分泌出耐药HBV病毒颗粒。目前国外已有构建此类细胞株及相关的研究,但尚无公认、广泛使用的商品化稳定表达耐药HBV细胞株,因此有必要建立稳定表达耐药HBV体外细胞模型。将DNA有效整合入细胞基因组,其方法主要有非病毒载体法及病毒载体法。前者包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、电击穿孔法及显微注射法等,这些方法得到稳定细胞株的效率相当低。后者主要是逆转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体等方法。其中逆转录病毒载体及慢病毒载体对目的基因转移效率高,容易得到稳定表达株。逆转录病毒载体为基于逆转录病毒构建的病毒载体。在构建时,删去了pol、env和gag基因,保留了5’端和3’端的LTR及包装信号ψ序列,并增加了多克隆位点、抗性标记,与质粒拼接而成。而病毒颗粒识别、包装等过程所必须的gag、pol与env基因整合在相应的包装细胞基因组内。逆转录病毒载体转染包装细胞后,将载体DNA插入包装细胞基因组。载体DNA转录出含标记基因、目的基因、包装信号的RNA序列,结合包装细胞内已提供gag、pol与env蛋白,包装出有感染能力的假病毒颗粒。这种假病毒颗粒可感染靶细胞,并将整条病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA上,使之成为其一部分,并能稳定表达目的基因。研究目的构建含rtM204V、rtL180M突变位点的拉米夫定耐药1.3拷贝HBV基因及其重组逆转录病毒载体,通过逆转录病毒载体系统的方法建立表达YMDD变异HBV的稳定细胞株,并进一步鉴定所构建细胞株HBV复制及抗原表达情况。通过本研究探索构建其他核苷(酸)类似物耐药HBV稳定细胞株的方法。研究方法1.使用突变引物YVS、YVA对重组杆状病毒载体上的1.3拷贝野生株HBV的进行rtM204V定点突变。通过突变引物526MS、526MA对目的基因进行rtL180M位点突变。PCR-RFLP鉴定突变是否成功。携带已经突变的目的基因的杆状病毒重组载体瞬时转染细胞以测定目的基因复制活性。2.携带1.3拷贝拉米夫定耐药HBV基因的重组杆状病毒载体质粒与逆转录病毒载体pLNCX2分别进行HindⅢ、SalⅠ双酶切。纯化回收目的片段进行连接,获得含反向目的基因的重组逆转录病毒载体pRV-oYVDDHBV。通过引物HSS和HSA扩增出1.3拷贝拉米夫定耐药HBV基因,并使得PCR产物5’端带有HindⅢ位点,3’端带有SalⅠ位点,经酶切、连接后获得含正向目的基因的重组逆转录病毒载体pRV-YVDDHBV。使用酶切、PCR及测序的方法鉴定所构建重组载体。3.重组逆转录病毒载体脂质体法转染PT67包装细胞,含G418培养基压力筛选后挑取稳定转染细胞克隆,获得含病毒培养上清。4.倍比稀释含重组病毒颗粒的包装细胞培养上清,梯度浓度的含病毒上清感染NIH3T3细胞,含G418培养基压力筛选,以确定病毒滴度。取经感染并筛选后仍存活的NIH3T3细胞,其培养上清再次感染新复苏的NIH3T3细胞,G418压力筛选以确定有无辅助病毒存在。5.含重组病毒颗粒的包装细胞培养上清感染HepG2细胞,经G418筛选稳定细胞株,挑取稳定细胞克隆并扩大培养,最终获得经单克隆分化成长起的细胞株。Abbott化学发光全自动免疫分析仪检测HepG2-YVDDHBV培养上清中的HBsAg及HBeAg的表达,荧光定量法检测上清HBV DNA,免疫组化检测细胞内HBcAg的表达,鉴定上清中HBV复制及抗原表达情况,测序鉴定HBV耐药变异情况。研究结果1.PCR-RFLP的方法鉴定rtM204V突变成功。用逆转录病毒载体多克隆位点两端引物进行PCR及测序,证实定点突变成功。携带已经突变的目的基因的杆状病毒重组载体瞬时转染HepG2细胞,ELISA方法检测HBsAg及HBeAg的表达均阳性。2.HindⅢ及SalⅠ双酶切重组逆转录病毒载体及逆转录病毒载体多克隆位点两端引物PCR检测,两种方法均证实正向插入耐药HBV基因及反向插入耐药HBV基因两种重组逆转录病毒载体构建成功。3.重组逆转录病毒载体转染包装细胞并经过2周G418压力筛选,得到产病毒包装细胞多株。选取正向和反向插入目的基因两实验组细胞各一株行病毒滴度滴定。G418筛选10天后,10~6倍浓度稀释上清所感染的培养孔则均无细胞生长,而此浓度下感染的培养孔内则有细胞克隆存在,考虑病毒滴度均约在1×10~5CFU/ml。经检测无辅助病毒存在。4.含反向插入1.3拷贝HBV基因的重组病毒上清感染HepG2细胞并行G418筛选,获得的稳定细胞株常规ELISA法检测培养上清中的HBsAg及HBeAg均为阴性。5.含正向插入1.3拷贝耐药HBV基因的病毒上清感染HepG2细胞,共筛选出7株HBsAg及HBeAg均表达阳性的细胞克隆。挑取其中表达较高一株继续培养并行进一步鉴定,命名为HepG2-YVDDHBV。同时在未突变野生株HBV病毒实验对照组筛选出一株命名为HepG2-WHBV。6.检测HepG2-YVDDHBV培养上清中的HBsAg及HBeAg的表达及HBV DNA定量,2.2.15细胞株及未突变野生株HepG2-WHBV作为对照。结果均为阳性,但HepG2-sYVDDHBV的HBsAg、HBeAg表达及HBV DNA复制与2.2.15细胞株相比均明显低。持续培养8周HepG2-YVDDHBV细胞株培养上清的HBsAg、HBeAg均有持续表达。7.免疫组化检测细胞内HBcAg的表达,结果显示HepG2-YVDDHBV细胞内HBcAg阳性。研究结论成功构建了含rtM204V/rtL180M位点突变的1.3拷贝拉米夫定耐药HBV基因的重组逆转录病毒载体。成功将重组载体转染PT67包装细胞,获得感染性重组病毒颗粒。通过逆转录病毒载体系统的方法,建立了含rtM204V/rtL180M变异HBV基因的稳定细胞株HepG2-YVDDHBV。经检测其HBsAg及HBeAg的表达均阳性,免疫组化可检测到细胞内HBcAg的表达,荧光定量法检测上清中HBVDNA为阳性。培养时间超过8周,HBsAg及HBeAg、HBV DNA持续阳性。测序结果显示上清中HBV存在rtM204V及rtL180M变异,初步认为该细胞株支持拉米夫定耐药HBV复制及表达,但其表达复制水平较低,距实用阶段尚有差距。