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目的:本研究对菘蓝COMT（IiCOMT）进行了基因克隆、表达特征分析及体外催化功能评价,以期为通过分子育种等方式提高木脂素类抗病毒活性成分的含量,培育高品质務蓝品系奠定基础。同时,以氧甲基转移酶（OMT）为例,借助模式植物拟南芥,开发一种基于荧光探针的植物在体OMTs活性检测方法,并用于菘蓝体内OMT活性的表征。方法:1.通过RT-PCR技术扩增IiCOMT基因,使用jcvi软件、MEGA7.0.21软件、ExPASy、T-COFFEE、SignalP-5.0 和 TMHMM Server v.2.0 等在线工具对IiCOMT 进行生物信息学分析;使用qRT-PCR技术检测IiCOMT基因在根、茎、叶中转录水平的表达情况。2.构建pET28a-IiCOMT体外重组蛋白,并通过体外酶活实验验证其体外催化活性;以咖啡醇、咖啡酸、槲皮素和木犀草素为底物,根据米氏方程法测定IiCOMT对4个底物的酶动力学参数。3.以模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.为例,构建其OMT（包括AtCOMT和AtCCoAOMT）体外重组蛋白;通过体外酶活检测进行底物探针的筛选,并测定拟南芥OMT对选定底物探针的酶动力学参数;将选定探针作为底物进行拟南芥前体饲喂,12 h后使用激光共聚焦显微镜检测其叶片OMTs的在体活性,同时使用UHPLC-QTOF-MS进行饲喂3-BTD后拟南芥体内代谢组分的测定;将传统通过重组荧光蛋白检测催化酶亚细胞定位的方法与新方法进行比较,并将新方法用于检测菘蓝叶片中OMT的活性。结果:1.IiCOMTs的序列及组织表达特征:扩增获得4个IiCOMT基因,碱基数约为1000 bp,编码蛋白约360个氨基酸,分子量约40 kDa;同源序列比对结果显示,4个IiCOMT均与拟南芥COMT（AtCOMT）具有较高同源性,共线性分析结果表明位于菘蓝基因组5号染色体的IiCOMT1-3与拟南芥基因组5号染色体的AtCOMT具有共线性关系,但位于7号染色体的IiCOMT未显现共线性关系;4个IiCOMT的氨基酸序列中均含有5个OMT的保守域和3个与甲基供体SAM结合相关的保守域。系统进化树分析结果表明IiCOMT1和IiCOMT3聚为一类,与甘蔗和芒同源性达87%;IiCOMT2和IiCOMT4聚为一类,IiCOMT2与小麦和高茅草同源性达93%,IiCOMT4与柳枝稷同源性达94%。实时荧光定量PCR检测结果发现IiCOMT1在根、茎、叶中表达量均最高,而IiCOMT4均最低,且IiCOMTs在根中的表达水平显著高于其他组织。2.IiCOMTs的体外催化特征:4个IiCOMT均具有催化咖啡醇、咖啡酸、槲皮素、木犀草素和5-羟基阿魏酸甲基化的功能。4个IiCOMT对咖啡醇、咖啡酸、槲皮素和木犀草素具有不同的催化效率,其中IiCOMT3对4个底物的催化效率均最高（咖啡醇:kcat/Km=6195.68±147.25 mM-1 min-1;咖啡酸:kcat/Km=1363.26± 91.44 mM-1 min-1;槲皮素:kcat/Km=11091.14±161.45 mM-1 min-1;木犀草素:kcat/Km=4171.57± 98.59 mM-1 min-1）。总的来说,IiCOMTs与不同底物的亲和力大小顺序为槲皮素＞木犀草素＞咖啡醇＞咖啡酸;催化专属性高低顺序为槲皮素＞咖啡醇＞木犀草素＞咖啡酸。3.植物在体OMTs活性检测方法的建立:从14个化合物中筛选出产物荧光强度最高的底物探针3-BTD,其酶动力学参数测定结果显示AtCOMT和AtCCoAOMT均对3-BTD探针具有较好的亲和力和催化专属性（AtCOMT:Km=0.66±0.03 μM,kcat/Km=54.43±1.07 μM-1 min-1;AtCCoAOMT:Km=6.46± 0.41 μM,kcat/Km=1946.79± 105.01μM-1 min-1）。共聚焦观察结果表明饲喂3-BTD的野生型拟南芥出现荧光信号;而未饲喂3-BTD的野生型拟南芥和饲喂3-BTD的COMT＆CCoAOMT双突变体拟南芥均无荧光;同时在饲喂3-BTD的野生型拟南芥中检测到了产生荧光信号的目标甲基化产物3-BTMD,证明3-BTD可以作为准确真实表征拟南芥中OMTs酶活力的理想探针。在拟南芥叶片中,基于3-BTD探针检测的AtCOMT和AtCCoAOMT活性位置均位于细胞质,而传统重组荧光蛋白法结果显示AtCOMT定位于细胞质,但AtCCoAOMT定位于细胞质和细胞核。将建立的基于3-BTD探针的植物在体OMTs活性检测方法用于检测菘蓝叶片中OMTs的活性,发现其主要定位于细胞质中。结论:1.获得了菘蓝4个IiCOMT基因,IiCOMT1在根、茎、叶中表达量均最高,IiCOMT4均最低,且各个IiCOMT在根中的表达水平显著高于其他组织,与落叶松脂素在根中积累水平较高的模式相一致。2.4个IiCOMT均具有甲基化咖啡醇、咖啡酸、槲皮素、木犀草素和5-羟基阿魏酸的功能,但催化效率具有差异,4个IiCOMT中IiCOMT3催化活性最好,IiCOMTs对醇类和黄酮类底物的选择性远远大于酸类底物。3.以模式植物拟南芥为例,建立了一种基于荧光探针的植物在体OMTs活性检测方法,完善人们对OMT酶定位和活性的认识,并检测出菘蓝叶片中OMTs的酶活性主要定位于细胞质中。