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目的:Bmi-1基因是多梳基因家族的重要成员之一,在调控细胞增殖,维持造血干细胞的自我更新及分化方面起着重要作用。已知Bmi-1基因主要通过调控INK4a/ARF位点来调节细胞的增殖和衰老。研究发现Bmi-1基因在乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌及鼻咽癌等多种肿瘤细胞中呈高表达并与肿瘤的预后不良密切相关。下调Bmi-1基因的表达能有效抑制肿瘤细胞的生长、增殖和体内成瘤能力,提示Bmi-1可能参与肿瘤的形成,有望成为肿瘤潜在的治疗靶点。为此本研究选择具有INK4A/ARF位点的肺腺癌SPC-A1细胞作为研究对象,通过siRNA干扰技术来沉默SPC-A1细胞中Bmi-1基因的表达,观察其对SPC-A1细胞生长和增殖的影响,并探讨Bmi-1可能参与肺癌细胞增殖的分子机制。方法:1.本实验选用已确定有效的siRNA序列进行病毒包装,构建逆转录病毒Si-Bmi1pSUPERretro-Neo,然后感染到SPC-A1细胞中。建立稳定表达Bmi-1-siRNA的肺癌细胞株(用100μg/ml G418维持培养),同时以空载体(Si-Bmi1-ctr pSUPERretro-Neo)感染SPC-A1细胞和野生型SPC-A1细胞作为对照。2.采用RT-PCR和Western blot方法分别从mRNA水平和蛋白水平检测转染Bmi-1-siRNA后SPC-A1细胞中Bmi-1表达情况。3.应用台盼蓝拒染法、MTT比色法和平板克隆形成实验,分别检测沉默Bmi-1基因后对SPC-A1增殖和体外集落形成能力的影响。4.利用流式细胞术分析SPC-A1各组细胞的细胞周期分布情况。5.选择裸鼠,腋窝皮下分别注射SPC-A1三组细胞,建立裸鼠异种移植瘤模型,观察沉默Bmi-1基因后SPC-A1细胞在裸鼠体内的成瘤情况。6.Western blot方法检测增殖通路相关分子:p16INK4a、p53、CyclinD1、PTEN、Akt和Ser473p-Akt等蛋白表达。7.PTEN抑制剂作用于SPC-A1-Bmi-1-siRNA细胞,观察其是否能重塑Bmi-1和Ser473p-Akt的表达。8.应用CO-IP方法来检测Bmi-1和PTEN之间是否存在着蛋白与蛋白的相互作用。结果:1.逆转录病毒介导的Bmi-1-siRNA被转染后,通过Neo基因的表达情况证实重组质粒被成功的转染进了SPC-A1的细胞中,并且荧光显微镜观察其转染效率为100%。同时RT-PCR和Western blot结果也显示Bmi-1-siRNA成功地抑制了SPC-A1细胞中Bmi-1的mRNA和蛋白表达(p <0.01;p <0.01)。2.台盼蓝拒染法结果显示,转染Bmi-1-siRNA后,SPC-A1细胞的活力并没有受到影响(p>0.05);MTT结果则显示,转染Bmi-1-siRNA能够明显抑制SPC-A1细胞的增殖能力(p <0.05)。3.平板克隆实验结果表明,沉默Bmi-1基因的表达有效地抑制了SPC-A1细胞的单细胞集落形成能力和自我更新能力(p <0.01)。4.流式细胞术结果表明,SPC-A1细胞被沉默Bmi-1基因后,阻滞在G1期的肺腺癌细胞明显增多(p <0.05)。5.裸鼠体内成瘤实验表明,沉默Bmi-1基因的表达后使SPC-A1细胞在裸鼠体内成瘤能力明显下降(p <0.01)。6.沉默Bmi-1基因的表达后p16INK4a和p53蛋白表达无变化(p>0.05; p>0.05),CyclinD1表达下降(p <0.01),Akt活性无改变(p>0.05),Ser473p-Akt活性下降(p <0.01),PTEN表达上调(p <0.01)。7. PTEN抑制剂作用于SPC-A1-Bmi-1-siRNA细胞后,SPC-A1细胞的Bmi-1和Ser473p-Akt表达得以重塑。8.CO-IP结果显示Bmi-1和PTEN蛋白质之间存在着相互作用。结论:Bmi-1-siRNA通过将肺腺癌SPC-A1细胞周期阻滞于G1期来抑制肿瘤细胞的生长和增殖,这种抑制作用并非依赖p16INK4a来调控CyclinD1的表达进而参与肿瘤细胞的增殖;在SPC-A1细胞有可能存在这样的一条信号通路:Bmi-1→PTEN→PI3K/p-Akt→CyclinD1,这条通路可能在Bmi-1调控肺腺癌细胞增殖中至关重要;在肺腺癌细胞中的增殖通路中,Bmi-1和PTEN之间的相互作用也是非常重要的。