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桔小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）是一种重要的世界性农业害虫,隶属于双翅目Diptera,实蝇科Trypetidae,果实蝇属Bactrocera Macquart。桔小实蝇可危害包括柑橘、番荔枝、杨桃、芒果以及枇杷等在内的多种重要果蔬,其成虫繁殖力高,适应能力强,造成的经济损失严重,已被多个国家和地区列为检疫性害虫。交配是昆虫选择最佳配偶以及产生后代最基本的行为方式。雄虫在交配过程中将精液转移至雌虫体内,以完成世代延续。精液中除用于授精的精子外,其它主要成分为雄性附腺合成并分泌的附腺液,雄性附腺蛋白（male accessory gland proteins,Acps）是附腺液中主要的功能活性分子,与其它因子如保幼激素（Juvenile hormone,JH）等共同影响雌雄虫的交配过程。本课题组前期利用转录组—蛋白质组关联分析的方法在桔小实蝇雄性附腺中鉴定到1个新的功能未知的Acp,根据功能保守性预测其具有典型的JHBP结构域,故命名为BdJHBP-like。本学位论文运用RT-PCR技术克隆获得BdJHBP-like开放阅读框（open reading frame,ORF）,通过序列比对分析发现其属于Takeout基因家族;利用荧光定量PCR技术,解析BdJHBP-like的时空表达模式,同时分析其在保幼激素类似物烯虫酯（Methoprene）和蜕皮激素20E处理后的表达模式,以及响应生物节律的表达模式;利用RNAi技术特异性干扰BdJHBP-like表达,分析其在桔小实蝇雄虫生殖行为中的生理功能;此外基于桔小实蝇BdJHBP-like建立了CRISPR/Cas9基因编辑技术。研究结果将在理论上丰富对昆虫雄性附腺蛋白生理功能的认识,为后续研究该类蛋白在生殖调控方面的机理提供重要的理论基础。具体研究结果如下:1桔小实蝇BdJHBP-like鉴定及表达模式基于桔小实蝇基因组和转录组数据库,克隆获得BdJHBP-like的ORF,并推导其编码的氨基酸序列。利用生物信息学软件分析BdJHBP-like的保守序列、跨膜结构等分子特性,BdJHBP-like第28265位氨基酸之间存在1个保守的JHBP结构域,同时在蛋白N端含有19个氨基酸的信号肽,为分泌型蛋白。通过序列比对及系统进化关系分析发现其属于Takeout家族。利用qPCR技术解析BdJHBP-like在桔小实蝇卵、幼虫、蛹及成虫阶段的表达模式,结果表明BdJHBP-like在雄虫性成熟期高表达,在卵、幼虫、蛹及雌虫中表达水平相对较低。分析BdJHBP-like在桔小实蝇性成熟雄成虫的头部、胸部、腹部、中肠、脂肪体、马氏管、精巢和雄性附腺的组织表达模式,发现该基因在雄性附腺中表达量显著高于其它组织,推测该基因与桔小实蝇雄成虫的生殖功能相关。2 BdJHBP-like响应外源激素刺激及生物节律的表达模式保幼激素类似物烯虫酯处理5日龄雄成虫后,BdJHBP-like表达量在1 h出现显著性下调,随后逐渐上升至正常水平,在24 h时表达进一步增加;同时保幼激素信号通路基因BdKr-h1则在处理后1、3和12 h出现下调,随后上升至正常水平;JH受体基因BdMet在处理后24 h内均显著下调。在蜕皮激素20E处理后,BdJHBP-like以及蜕皮激素合成通路基因BdCyp307a1（Spook）在24 h内均显著性下调。分析BdJHBP-like响应生物节律的表达模式,结果显示BdJHBP-like具有一定的节律性变化规律,在由黑暗转至光照过程中表达量达上升,并且持续4-6 h,而在由光照转至黑暗的过程表达量下降。3 BdJHBP-like参与桔小实蝇生殖行为的生理功能研究基于BdJHBP-like时空表达模式,采用显微注射法对桔小实蝇7日龄雄成虫进行靶基因干扰。结果显示,注射靶基因dsRNA 48 h后,BdJHBP-like显著性下调,说明靶基因的表达能被特异性dsRNA抑制。观察在第5、7日龄时连续干扰后桔小实蝇雄成虫的交配行为发现,雄成虫与雌成虫的交配率以及交配时长显著降低,同时与之交配的雌成虫的产卵量及卵的孵化率显著低于对照。4利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除桔小实蝇BdJHBP-like根据桔小实蝇BdJHBP-like基因组DNA序列和基因编辑对靶标位点选择要求,在第1、2个外显子分别选择1、2个靶标位点,用于体外合成sgRNA,与Cas9酶按照一定的浓度比例混合进行胚胎注射。研究共注射了573粒胚胎,孵化出128头幼虫,化蛹30粒,羽化13头成虫,其中5头出现翅或足发育畸形。提取未羽化的蛹及羽化畸形的成虫基因组DNA,用特异性引物扩增BdJHBP-like,将PCR产物送公司测序,出现套峰的PCR产物进行单克隆,共检测15个阳性克隆,其中在距离第2个靶点113 bp的位置检测到3种突变,距离第3个靶点32 bp的位置检测到9种突变。随后将存活的8头G0代个体饲养至性成熟期,使其与野生型桔小实蝇成虫单对配对进行交配实验,产生后代后提取G0代基因组DNA,PCR扩增BdJHBP-like测序结果显示未发生突变。