亚洲带绦虫六钩蚴Ta18基因的克隆、表达及其芽孢益生菌型饲料添加剂的初步研制

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目的:从亚洲带绦虫(Taenia asiatica)六钩蚴cDNA文库中克隆出Ta18基因(亚洲带绦虫六钩蚴18kDa基因),分析预测其编码蛋白的结构和生物学功能,对其进行克隆表达、免疫学特性分析,构建重组Ta18枯草芽孢工程菌并对枯草芽孢益生菌型饲料添加剂进行初步研制。  方法:用RT-PCR方法从亚洲带绦虫六钩蚴cDNA中获取Ta18基因,通过测序获得目的基因序列,利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)、瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASy)中有关的生物信息学分析工具,结合其它生物信息学分析软件包,预测、分析基因编码的蛋白质的结构与生物学功能。将Ta18基因克隆到原核表达质粒 pET-28a(+)中,在大肠杆菌 BL-21/DE3中诱导表达,表达产物经纯化后用以免疫SD大鼠制备免疫血清。用蛋白印迹(Western Blotting)方法初步分析纯化的重组蛋白的免疫学特性。用RT-PCR方法从亚洲带绦虫虫卵、成虫不同部位的cDNA中检测Ta18基因的表达情况。使用枯草芽孢外壳主要成分CotC作为融合蛋白启动子,构建 Pus186-CotC-Ta18融合表达质粒,转化入枯草杆菌WB600。使用DSM(Difco Sporulation Medium)培养基诱导芽孢生成,36h后收集芽孢。提取芽孢外壳蛋白。使用Ta18抗血清,蛋白印迹验证外源蛋白在重组芽孢表面的表达。  结果:成功克隆出Ta18基因,全长396bp,编码131个氨基酸,其序列包含完整开放阅读框,推导出的氨基酸序列与GenBank中牛带绦虫18kD蛋白的同源性最高,一致性达99%,与猪带绦虫一致性达97%。蛋白理化性质稳定,MotifScan分析显示 Ta18含有纤连蛋白 FnⅢ型结构域。PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-Ta18构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌 BL-21/DE3中获得可溶性表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,具有免疫原性;同时重组蛋白也能被亚洲带绦虫病患者、猪带绦虫患者和牛带绦虫患者血清识别,具有较好的免疫反应性。研究还发现Ta18基因在亚洲带绦虫成虫的头节、成节、孕节中都有表达。成功构建了 Pus186-CotC-Ta18融合表达质粒并转化入枯草杆菌WB600,DSM培养基培养36h诱导芽孢生成,提取芽孢外壳蛋白行15%SDS-PAGE,结果表明目的基因在芽孢表面高效表达,芽孢外壳蛋白能被重组蛋白Ta18免疫的SD大鼠血清识别,具有免疫原性。  结论:成功克隆出亚洲带绦虫六钩蚴Ta18基因。Ta18蛋白具有较好的免疫原性,并与其他绦虫的感染血清存在着交叉反应。该基因不仅在六钩蚴阶段表达,在成虫各部位也同时存在一定的表达。使用枯草杆菌芽孢作为疫苗的载体,疫苗候选分子Ta18能在其表面表达并具有免疫原性,为饲料添加剂的研制提供了理论基础。
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