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内蒙古阿尔巴斯绒山羊因羊绒产量高、品质好而闻名,目前对于绒毛生长的机理研究越来越引起人们的重视。这方面的研究不仅可以深入了解绒毛的调控机理,同时在今后绒山羊的育种工作以及相关的科学研究中也具有重要的意义。为了探究绒山羊绒毛生长的机制,本实验选择与羊绒生长发育密切相关的初级毛乳头细胞(Primary hair follicle-Dermal papilla cells,PHF-DPC)和次级毛乳头细胞(Secondary hair follicle-Dermal papilla cells,SHF-DPC)作为细胞模型,选取与毛囊发育相关基因SPP1(Secreted phosphoprotein 1)和HGF(Hepatocyte growth factor),构建SPP1和HGF基因的过表达载体和干扰载体,通过转染PHF-DPC和SHF-DPC,观察目的基因过表达和低表达对绒山羊DPC增殖的影响,为今后进一步探究相关基因调控毛囊生长发育机理提供实验依据。1、内蒙古阿尔巴斯绒山羊PHF-DPC和SHF-DPC的培养及鉴定用含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液培养PHF-DPC和SHF-DPC,通过细胞免疫荧光检测,对两种细胞进行鉴定。结果显示两种细胞都表现出ɑ-SMA和CD144标志蛋白的阳性表达,证明培养的细胞确实为PHF-DPC和SHFDPC,可以用于进一步的实验研究。2、过表达载体和干扰载体的构建对目的基因进行克隆,并通过对目的基因及骨架载体酶切和连接实验,分别成功构建了SPP1基因和HGF基因的过表达载体和干扰载体。3、SPP1基因过表达和干扰载体对细胞的转染及检测运用脂质体转染的方法,将SPP1基因过表达载体和干扰载体成功转入PHFDPC和SHF-DPC中。对成功转染两种载体的细胞通过q-PCR和Western Blot实验检测SPP1基因表达量的变化,以未转染任何载体的PHF-DPC和SHF-DPC做为对照组。结果PHF-DPC中SPP1过表达和干扰组的表达量分别是实验对照组的14.03和0.89倍。在SHF-DPC中,SPP1过表达和干扰组的表达量分别是对照组的8.19和0.37倍。结果证明,本实验成功建立了SPP1基因过表达和干扰的细胞系。4、SPP1基因对DPC增殖的调控作用通过CCK8细胞增殖检测可知:在PHF-DPC中,SPP1基因的过表达组在第1d、第2d和第3d的增殖速率显著高于实验对照组,在第2d的增殖速率明显加快,而干扰组的增殖速率则明显低于实验对照组。在SHF-DPC中,SPP1基因过表达组的增殖速率也高于实验对照组,而干扰组的增殖速率低于实验对照组。利用EdU实验进一步检测SPP1基因对PHF-DPC和SHF-DPC增殖的影响,以未转染任何质粒的PHF-DPC和SHF-DPC作为对照组。结果得知,通过对细胞生长情况的观察,转染SPP1过表达载体的DPC中EdU阳性细胞数量明显多于对照组,转染SPP1干扰载体的DPC中EdU阳性细胞数量明显少于对照组。结果证明SPP1基因过表达对DPC的增殖有促进作用,而干扰SPP1基因后DPC的增殖能力下降。利用q-PCR和Western Blot检测与DPC增殖相关的CD44、IL-6和ITGB1基因的表达量。结果发现,在转染SPP1基因过表达载体的DPC中,CD44、IL-6和ITGB1基因表达量随之增加,在转染SPP1基因干扰载体的DPC中,CD44、IL-6和ITGB1基因表达量随之减少。实验结果表明,两种DPC中SPP1基因的表达变化与CD44、IL-6和ITGB1基因的表达变化趋势一致。证明了在两种DPC中SPP1基因与CD44、IL-6和ITGB1基因的表达呈正相关性。实验结果进一步说明SPP1基因对于DPC的增殖具有正调控作用。5、HGF基因过表达载体和干扰载体对细胞的转染及检测运用脂质体转染的方法,将HGF基因过表达载体和干扰载体成功转入PHFDPC和SHF-DPC中。对成功转染两种载体的细胞通过q-PCR和Western Blot实验检测HGF基因表达量的变化,以未转染任何载体的PHF-DPC和SHF-DPC做为对照组。发现PHF-DPC中HGF过表达和干扰组的表达量分别是实验对照组的2.98和0.46倍,而在SHF-DPC中,HGF过表达和干扰组的表达量分别是对照组的18.83和0.62倍。结果证明,本实验成功建立了HGF基因过表达和干扰的细胞系。6、HGF基因对DPC增殖的调控作用通过CCK8细胞增殖检测可知:在SHF-DPC中,HGF基因的过表达组增殖速率显著高于实验对照组,在第2d的增殖速率明显加快,而干扰组的增殖速率则明显低于实验对照组。在PHF-DPC中,HGF基因过表达组的增殖速率也高于实验对照组,而干扰组的增殖速率低于实验对照组。利用EdU实验进一步检测HGF基因对PHF-DPC和SHF-DPC增殖的影响,以未转染任何质粒的PHF-DPC和SHF-DPC作为对照组。结果得知,通过对细胞生长情况的观察,转染HGF过表达载体的DPC中EdU阳性细胞数量明显多于对照组,转染HGF干扰载体的DPC中EdU阳性细胞数量明显少于对照组。结果证明HGF基因过表达对DPC的增殖有促进作用,而干扰HGF基因后DPC的增殖能力下降。利用q-PCR和Western Blot检测与DPC增殖相关的TGF-β和HGF基因特定受体C-met基因的表达量。结果发现,在转染HGF基因过表达载体的DPC中C-met基因表达量随之增加,TGF-β基因表达量减少,在转染HGF基因干扰载体的DPC中,C-met基因表达量随之减少,TGF-β基因表达量增加。实验结果表明,两种DPC中HGF基因的表达变化与C-met基因的表达变化呈正相关,与TGF-β呈负相关。上述实验研究结果表明:SPP1和HGF基因及其相关基因均在DPC的增殖过程中发挥重要作用,且SPP1和HGF基因对DPC的增殖均为正调控作用。在毛乳头细胞中SPP1基因与CD44、IL-6和ITGB1基因呈正相关性的调控,HGF基因与C-met基因呈正相关性的调控,与TGF-β基因呈负相关性的调控。实验结果进一步说明SPP1和HGF基因对于DPC的增殖有正调控作用。