华山松大小蠹保幼激素合成与信号传导基因功能研究

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保幼激素(Juvenile hormone,JH)与蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)在昆虫生长发育中不仅协同调控幼虫蜕皮及化蛹、刺激成虫生殖系统发育与成熟,还诱导滞育和衰老等生理活动,成为近年来昆虫学研究的热点之一。目前小蠹虫(华山松大小蠹)保幼激素的研究主要集中于保幼激素对信息素合成的影响,保幼激素合成甲羟戊酸路径部分基因的克隆以及对保幼激素的响应等方面,而对小蠹虫(华山松大小蠹)保幼激素合成关键酶基因、信号传导通路基因的作用尚未见相关报道。为此,本研究通过对华山松大小蠹保幼激素合成关键酶,抑咽侧体素AST、蜕皮激素受体基因、蜕皮激素和保幼激素信号传导基因的序列特征、系统发育和基因表达,保幼激素合成和信号传导主要基因的功能等研究,旨在揭示保幼激素和蜕皮激素对华山松大小蠹蜕皮和变态的调控机制。取得以下研究结果:1.获得华山松大小蠹保幼激素合成关键基因Da JHAMT的全长序列,华山松大小蠹Da JHAMT基因具有典型的JHAMT序列特征,与山松大小蠹Dpon JHAMT相似度最高;华山松大小蠹Da JHAMT在幼虫期和蛹期表达量最高;幼虫期和蛹期Da JHAMT响应保幼激素的诱导,表达量显著上调;蜕皮激素诱导幼虫期Da JHAMT基因的表达上调,抑制蛹期Da JHAMT基因的表达下调。Da JHAMT的RNA干扰抑制了保幼激素合成路径上游部分基因的表达,使蛹羽化率降低,羽化成虫出现翅型萎缩。证明Da JHAMT是华山松大小蠹保幼激素合成路径的关键调控基因。2.获得华山松大小蠹保幼激素抑咽侧体素Da AST基因的全长序列,且华山松大小蠹Da AST在成虫中高表达,在幼虫、蛹头部高表达,成虫前中肠高表达;保幼激素和蜕皮激素显著诱导华山松大小蠹幼虫Da AST表达显著上调,但蜕皮激素使蛹Da AST表达显著下降,这说明Da AST可能抑制华山松大小蠹咽侧体合成保幼激素,且在幼虫期更加活跃,同时蜕皮激素可能通过诱导Da AST高表达,从而抑制保幼激素的合成。Da AST的RNA干扰,使华山松大小蠹Da JHAMT基因表达量显著上调,进一步证明华山松大小蠹Da AST基因对保幼激素的合成具有抑制作用。同时,Da AST干扰后,华山松大小蠹蛹存活率,羽化率显著下降,羽化成虫畸形率显著升高,这说明抑咽侧体素AST对华山松大小蠹维持正常的生长发育至关重要。3.获得华山松大小蠹蜕皮激素受体基因Da Ec R和蜕皮激素信号传导关键基因Da E75、Da Hr3和Da FTZ-F1全长序列;华山松大小蠹Da Ec R、Da E75、Da Hr3和Da FTZF1均在蜕皮期高表达,这说明华山松大小蠹Da Ec R、Da E75、Da Hr3和Da FTZ-F1基因参与华山松大小蠹蜕皮和变态。4.获得华山松大小蠹Da Kr-h1和Da Br-C基因的全长序列,Da Kr-h1和Da Br-C基因均在幼虫期高表达,Da Kr-h1在成虫前中肠表达量最高,Da Br-C在成虫生殖器表达量最高;保幼激素诱导华山松大小蠹幼虫和蛹Da Kr-h1表达量显著上调,但对Da Br-C的表达无显著影响;幼虫期Da Kr-h1基因受蜕皮激素的抑制表达显著下调,而蛹期Da Kr-h1基因受蜕皮激素的诱导表达显著上调;幼虫和蛹期Da Br-C受蜕皮激素的诱导表达量显著上调,这表明华山松大小蠹Da Kr-h1是保幼激素早期响应因子,Da Br-C是蜕皮激素早期响应因子。5.Da Kr-h1的RNA干扰显著影响蜕皮激素信号传导基因的表达,使早期响应基因Da Br-C的表达显著上调,提前羽化成虫的鞘翅发育畸形现象显著提升;幼虫期Da Krh1基因的干扰,使蛹提前出现,出现早熟蛹,而蛹期Da Kr-h1基因的干扰,使羽化成虫畸形率显著提高。由此可以得出Da Kr-h1和Da Br-C是华山松大小蠹保幼激素信号传导中的关键基因,在幼虫化蛹和成虫羽化中发挥着重要作用,华山松大小蠹Da Kr-h1通过抑制Da Br-C的表达,调控蜕皮激素的合成与传导,这为华山松大小蠹发育的人为干扰靶标筛选提供了重要的依据和方向。
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