生物大分子药物为所有无法透过细胞膜的分子量大于1.5KDa的生物内源性成分或采用生物技术制得的物质,包括蛋白质、多肽、抗体、核酸、聚糖、聚酯、甚至细胞。从1982年第一个基因工程产品-人胰岛素上市至今,已有140多种生物大分子药物投入临床应用。因此,针对生物大分子药物的研发与临床应用已受到人们的广泛关注。要正确评价一种新的生物因子在体内的疗效及安全性,须研究其在动物和人体内的吸收、分布、代谢和排泄的规律。与传统药物不同的是,生物大分子药物特别是蛋白质类药物,可与内源性蛋白质的结构相似,由共同的氨基酸组成,且生物半衰期短、血浆浓度低(ng/L或μg/L),大大增加了体内定量检测的难度。目前用于蛋白质多肽类生物分子及其药物的体内定量监测方法主要有免疫学分析法、同位素标记示踪法、生物活性检定法、色谱与质谱法等。然而,(1)免疫学分析法要求必备特异性抗体;(2)同位素标记失踪法存在放射性核素污染;(3)生物活性检定法的实验条件要求严格,且容易出现检测结果的不稳定；(4)色谱与质谱法是目前蛋白类药物浓度监测的最佳方法,但需要特殊的仪器设备与专门操作人员。因此,研究和开发简单安全且适用范围广的蛋白浓度检测新方法是必要的,这也是本课题研究的目的。生物素(biotin),分子质量约244.31u,可偶联在许多蛋白质多肽大分子上,而不对其理化性质、生物学活性产生明显影响。亲和素,是特异性结合生物素的蛋白。一分子亲和素可与四分子生物素结合,两者间的亲和力极强且不可逆。由于上述特点,亲和素-生物素系统在分子识别、相互作用、纯化、检测、固定、标记、病毒载体及非放射性药物靶向系统等研究中发挥着重要作用。但在多数情况下是将生物素标记抗体或抗原,与相应的抗原或抗体反应后,以酶或荧光素标记亲和素作为检测信号。本研究基于双抗体夹心ELISA的原理,利用亲和素-生物素的结合特点,建立了一种检测外源性蛋白质/多肽的血清动态浓度的新型方法,即包被亲和素-生物素标记蛋白-检测亲和素的双夹心体系,简称SA双夹心体系。该方法特异性强、灵敏度高,不依赖抗体或放射性同位素,且使用简便和成本廉价,并成功应用于两种生物素标记外源蛋白的小鼠血清动态浓度检测中,可望在外源蛋白多肽类大分子及其药物的体内定量检测和代谢动力学研究中广泛应用。一、亲和素-生物素标记蛋白/多肽双夹心体系的建立以链亲和素为捕获分子,加入待测生物素标记蛋白或多肽,辣根过氧化物酶标记链亲和素为检测分子,构建链亲和素-生物素标记大分子-酶链亲和素的双夹心体系(SA双夹心体系),并进行特异性、灵敏度、准确性及稳定性评价。结果显示,SA双夹心体系的检测特异性强,与非生物素化蛋白不存在非特异结合；灵敏度高,检测下限可达0.3125ng/ml,且可通过改变亲和素的固相包被浓度调整检测的敏感度与检测范围；准确性高,回收率为97.82%～107.92%；稳定性好,批内与批间检测的变异系数分别<5.76%和<8.42%。二、亲和素-生物素双夹心体系的体内应用从体外的平行性试验和小鼠的体内试验两方面,对SA双夹心体系是否适用于外源蛋白的体内浓度监测进行可行性评价。结果显示,血清内源性成分对双夹心体系的干扰可通过提高SA的固相包被浓度而消除,但对肝组织匀浆内源性成分的干扰不能减弱,提示目前该体系只适用于血清样品的检测。SA双夹心体系成功应用在生物素标记人血清白蛋白和生物素标记鸡卵黏蛋白的小鼠血清动态浓度检测中,进一步验证了该方法在检测血清样品时的可行性。与本实验室已建立的双抗体夹心ELISA进行比较,SA双夹心体系的检测灵敏度更佳,并且两者在检测同一血清样品时的定量结果相符。该结果提示我们建立的SA双夹心体系具有良好的灵敏度与准确性。恶性肿瘤是严重危害人类健康的重要疾病。近年发现肿瘤微环境的血管内皮细胞、免疫细胞及其他各种间质细胞在肿瘤发展和转移过程中同样具有举足轻重的作用。在大多数实体瘤中,髓源细胞是肿瘤间质的重要成分,占间质细胞50%以上,包括单核/巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞、肥大细胞及MDSCs等。肥大细胞作为一种多功能的、组织归巢型细胞,其在变态反应与抗寄生虫感染的作用已受到了人们的广泛关注。但随着在大多数实体瘤中发现大量肥大细胞的浸润,探索肥大细胞是否影响及如何影响肿瘤的发生发展逐渐得到学者们的关注。肥大细胞本身能够合成和释放多种生物活性因子,具有广泛的生物学作用,如促血管生成作用、免疫正向/负向调节等。肥大细胞的类型及所在微环境将影响其激活模式及释放产物的种类,最终导致不同的生物学作用。大多数研究表明肿瘤中的肥大细胞主要聚集在肿瘤周边与正常组织交界的部位,且多在血管周围,而肿瘤中心部位的肥大细胞较少甚至缺乏。因此,目前的实验研究主要关注肿瘤边界的肥大细胞,而关于癌巢中肥大细胞的数据较少。然而,有研究认为肿瘤中肥大细胞的分布部位与其功能有关：肿瘤边界的肥大细胞发挥促瘤作用,癌巢内的肥大细胞发挥抑瘤作用。此外,临床报道癌巢内的肥大细胞提示良好预后,如在前列腺癌和非小细胞肺癌中,但所涉及的机理尚不清楚。那么,随着肿瘤发展,肿瘤中不同部位的肥大细胞数目是如何变化?肿瘤微环境什么因素导致癌巢内肥大细胞数目较少?本文拟探索上述问题,建立小鼠肿瘤模型,观察在不同肿瘤生长阶段肿瘤组织不同部位的肥大细胞数目的变化。体外实验观察肿瘤细胞培养上清对肥大细胞成熟标志的影响,以试图阐明肿瘤微环境影响肥大细胞数目变化的可能机制。一、肿瘤组织肥大细胞的分布特征以小鼠CT26结肠癌为模型,采用甲苯胺蓝染色、免疫组织化学及流式细胞术观察瘤体组织中肥大细胞的时间空间分布特征。结果显示,瘤体中的肥大细胞处于脱颗粒状态,且主要聚集在肿瘤周边与正常皮肤的交界部位。随着瘤体生长,瘤组织中的肥大细胞数目发生了“先增后降”的变化：在肿瘤生长第7天达到峰值,随后逐渐减少,尤其肿瘤中心部位的肥大细胞数目变化较明显。此外,我们在人结肠癌组织中观察到相同现象：肥大细胞主要聚集在肿瘤侵袭边缘或周围正常组织,而癌巢中的肥大细胞较少甚至缺乏。二、肿瘤细胞培养上清对肥大细胞的影响基于肿瘤中心部位的肥大细胞随瘤体生长而减少,而肥大细胞表面的Kit受体是调节其生存信号的最重要的分子。本部分工作以体外诱导的骨髓肥大细胞(BMMC)为模型,给予CT26肿瘤培养上清(TSN)的作用,观察BMMC的分化状态及其表面C-Kit受体的表达。结果显示,在BMMC的培养初期,TSN的作用可改变其分化方向,并抑制其表面Kit受体的表达。这些数据可部分解释了肿瘤中心部位的肥大细胞较少甚至缺乏的现象。