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目的:氧化应激假说与神经变性疾病以及其他衰老相关疾病的发病机制密切相关,在众多神经退行性疾病中往往伴随着中枢神经系统内广泛的高水平的氧化应激损伤,目前尚无终止疾病进展的特效治疗药物。研究发现,鹅不食草具有显著的抗氧化活性。然而,目前还没有关于鹅不食草神经保护作用的报道,其抗氧化特性的潜在机制亦不清楚。本课题旨在从抗氧化作用介导神经保护的角度探讨鹅不食草乙醇提取物(ECM)以及鹅不食草单体化合物26(EBSC-26)在体内和体外的抗氧化活性及其潜在的作用机理。方法:体外研究中,我们选择了神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)和高分化小鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)做为实验对象,应用叔丁基过氧化氢(tBHP)和谷氨酸盐(glutamate)诱导细胞氧化损伤模型;ECM和EBSC-26在指定浓度下对细胞预处理,使用维生素E(vitamin E)作为部分实验的阳性对照;采用回流萃取法提取ECM,高效液相色谱技术从ECM中分离纯化单体化合物,光谱法进行结构鉴定。MTT法检测细胞活力(Cell Viability),DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)生成率,相关的试剂盒检测细胞丙二醛(MDA)和抗氧化蛋白(SOD,GSH)的含量及活力,JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位,Western blot法检测细胞MAPKs和Nrf2通路中及Bcl-2家族相关蛋白的表达。体内实验中,我们选择了 6月龄的昆明小鼠40只,采用D-gal(120 mg/kg/d)皮下注射和AlCl3(20 mg/kg/d)胃内给药造模,以建立亚急性衰老模型,实验分组:溶媒对照组(含10%乙醇生理盐水);D-半乳糖(120mg/kg)/三氯化铝(20mg/kg);D-半乳糖/三氯化铝+ECM低剂量(100mg/kg);D-半乳糖/三氯化铝+ECM中剂量(200 mg/kg);D-半乳糖/三氯化铝+ECM高剂量(400 mg/kg);D-半乳糖/三氯化铝+维生素E(80 mg/kg)。造模第60天起予以ECM或维生素E治疗,持续30天;造模干预90天后开始行为学测试。采用Nissl染色和HE染色观察海马神经元形态,相关的试剂盒检测海马和皮质脂质过氧化产物和抗氧化蛋白的含量及活力,Western blot法检测海马MAPKs和Nrf2通路中相关蛋白及突触相关蛋白PSD95,SYN的表达。采用试剂盒检测血清中肝肾功能相关指标。结果:ECM预处理可减轻glutamate或tBHP诱导SH-SY5Y和PC12细胞死亡:同时,ECM预处理可以减少细胞内ROS的生成和线粒体膜电位降低,降低细胞内脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的水平,增加抗氧化蛋白SOD含量及活力,并升高抗氧化分子GSH的含量。Western blot结果发现,tBHP可诱导SH-SY5Y和PC12细胞内p38 MAPK和JNK磷酸化水平升高,这个效应被ECM所阻断;与之相对的是,tBHP导致了细胞内ERK磷酸化水平降低,而ECM维持了 ERK的磷酸化水平。此外,在这两类细胞中,均发现ECM可以诱导核因子红系衍生2相关因子(Nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2,Nrf2)的核转位和其下游蛋白Ⅱ期解毒酶的上调,包括血红素加氧酶-1(HO-1)、超氧化物歧化酶-2(SOD2)和NAD(P)H:醌氧化还原酶-1(NQ0-1)的上调;在应用了 ERK抑制剂U0216处理的SH-SY5Y细胞中,ECM上调ERK磷酸化作用被削弱的同时,核内Nrf2及其下游Ⅱ期解毒酶的表达较未干预组均有所下调。同时,ECM可以通过维持Bcl-2/Bax比值抑制线粒体途径细胞凋亡。利用高效液相色谱技术,我们从ECM中分离纯化出了四种倍半萜类化合物,命名为EBSC-26A-EBSC-26D;经光谱鉴定和文献对比,确定四种化合物依次为短叶老鹤草素(6-0-Angeloylprenolin)、山金车内酯D(arnicolide D)、山金车内酯C(arnicolide C)和微杆菌素C(microhelenin C):相对于后两者,6-O-Angeloylprenolin 和 arnicolide D 可以更明显的改善tBHP诱导的SH-SY5Y和PC12细胞活力降低,在低剂量就有很好的效果;同时,6-O-Angeloylprenolin 和 arnicolide D 可显著减少 SH-SY5Y 细胞内 ROS 生成,促进Nrf2的核转位,诱导Ⅱ期解毒酶HO-1,NQO-1,SOD2的上调。在D-半乳糖(D-galactose)和氯化铝(AlC13)诱导的亚急性衰老小鼠模型中,给予ECM的治疗组可明显减少Morris水迷宫定位航行试验中小鼠的逃避潜伏期,增加空间探索实验中小鼠的穿越平台次数。同时ECM可以抑制海马和皮质内脂质过氧化水平,增加GSH和SOD的含量及抗氧化活力,维持海马神经元形态和其突触结构的稳定,维持海马内突触后密度蛋白95(PSD95)和突触素(SYN)的表达水平。体内机理研究方面,ECM同样可以抑制p38 MAPK和JNK的活化,增加ERK磷酸化水平,激活Nrf2信号通路,恢复小鼠海马中Ⅱ期解毒酶HO-1,NQO-1,SOD2的表达水平。毒理研究中,ECM各治疗组血清内谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST),ALT/AST,尿素氮(BUN),肌酐(Cr)的水平与模型组无显著统计学差异。结论:本研究探讨了鹅不食草乙醇提取物及其活性成分在改善氧化应激和神经保护方面的作用机制,我们发现ECM能够激活ERK/Nrf2信号通路保护神经元和细胞免受氧化应激诱导的损伤。分离的4种倍半萜类化合物中,6-O-Angeloylplenolin和Arnicolide D具有显著抗氧化活性。鹅不食草作为抗氧化剂和具有神经保护作用的化合物来源,为治疗神经退行性疾病的新药研发提供了新的选择。