目的:胃癌是常见消化道恶性肿瘤之一,占全球恶性肿瘤的第五位,也是位列第三的恶性肿瘤相关死亡疾病。在我国,大多数的患者在首次就医时即已经为进展期的胃癌,虽然以手术为主的综合治疗得到了一定的发展,但是患者的远期预后仍未能达到预期。对于复发转移的晚期胃癌患者,虽然可有超过50%的患者对多药联合的化疗具有反应,但是几乎所有的患者最终都将发生化疗耐药,中位生存时间也仅为10-12个月。因此,针对胃癌发生、发展,以及化疗耐药等的科学研究是提高患者预后的最重要手段之一。近年来,随着肿瘤干细胞研究的深入,胃癌干细胞也逐渐被证实。胃癌干细胞是一类特殊的恶性肿瘤细胞群,它们具有较强的自我更新能力和高致瘤性,而且具备多向分化的潜能,对化疗药物也具有较高的耐受性,许多研究发现其与肿瘤的复发转移和化疗耐药等生物学特性关系密切。CDK5RAP3是一种可以与细胞周期素依赖性激酶5的激活蛋白P35、P39结合的蛋白。目前关于CDK5RAP3对胃癌干细胞生物学特性的作用和机制的研究尚未见报道。本研究首先在胃癌病人组织中检测CDK5RAP3与胃癌干细胞标志物CD44的表达情况和相关性,并且分析两者表达与临床病理因素和患者远期生存的关系。其次,利用体内外细胞功能实验探究CDK5RAP3对胃癌干细胞成球生长能力、侵袭迁移能力、类器官形成、致瘤能力和化疗耐药性等的作用。最后,利用分子生物学实验研究其对胃癌干细胞生物学特性作用的潜在分子机制。本研究旨在明确CDK5RAP3对胃癌干细胞生物学特性中的作用及其调控机制,以期为胃癌干细胞的研究提供新的理论和思路,有助于胃癌治疗新靶点的研究。方法:1.通过IHC检测CDK5RAP3和CD44在胃癌及癌旁组织中的表达,分析两者的相关性及其与患者临床病理因素和预后的关系;2.Western Blot检测不同培养模式胃癌细胞中CDK5RAP3和胃癌干细胞标志物等的变化;3.利用包装好的慢病毒构建CDK5RAP3稳定过表达或下调表达的胃癌细胞株,并观察其对细胞成球生长能力的影响;4.在侵袭小室实验中观察CDK5RAP3对胃癌干细胞侵袭迁移能力的作用;5.构建稳定过表达CDK5RAP3的鼠源性胃癌细胞,观察其对胃癌干细胞类器官形成能力的影响;6.通过裸鼠皮下成瘤模型,验证CDK5RAP3对胃癌干细胞在体内致瘤性的作用;7.体内、外实验研究CDK5RAP3对胃癌干细胞化疗耐药性的作用;8.利用分子生物学技术探讨CDK5RAP3对胃癌干细胞生物学作用的潜在分子机制,分析CDK5RAP3对PI3K/AKT信号通路关键分子和EMT相关蛋白的影响。9.IHC检测EMT转录因子Snail在胃癌中表达的情况,并结合CD44与CDK5RAP3的表达,观察其与患者预后的作用。结果:1.IHC检测结果发现在胃癌组织中CDK5RAP3的表达低于其对应的癌旁组织,而CD44在胃癌组织中的表达则高于其对应的癌旁组织,且两者在胃癌组织中的表达呈明显的负相关。2.预后分析显示CDK5RAP3和CD44均是患者预后的独立影响因素,并且仅在CD44高表达患者中,CDK5RAP3高、低表达患者的生存差异具有统计学意义。3.体外细胞功能实验发现,CDK5RAP3的表达抑制了胃癌干细胞成球生长、侵袭迁移和类器官形成等的能力。4.裸鼠皮下移植瘤实验发现,CDK5RAP3能够降低胃癌干细胞的致瘤能力,并且显著降低了胃癌干细胞的化疗耐药性。5.PI3K的抑制剂能够抑制胃癌干细胞侵袭迁移的能力,并且使CDK5RAP3的蛋白表达水平升高,AKT磷酸化水平降低,同时EMT转录因子Snail和相关蛋白发生改变。6.过表达CDK5RAP3可以抑制AKT(S473)位点的磷酸化水平而降低EMT转录因子Snail的表达,从而介导胃癌干细胞的EMT活性。7.在CD44高表达患者中,CDK5RAP3高表达能够改善EMT转录因子Snail高表达对患者不良预后的作用。结论:1.CDK5RAP3与胃癌干细胞标志物CD44在胃癌中的表达呈负相关,两者均是患者预后的独立因素,有望成为胃癌预后预测的联合指标;2.CDK5RAP3不仅能够抑制胃癌干细胞成球生长、侵袭迁移和类器官形成能力,而且抑制了胃癌干细胞致瘤能力和化疗耐药性。3.CDK5RAP3能通过抑制AKT磷酸化水平从而降低EMT转录因子Snail的表达,降低了胃癌干细胞EMT活性,发挥抑癌作用。4.CD44高表达的患者中,CDK5RAP3的表达在能够改善Snail高表达患者的远期预后,在临床上可以作为治疗胃癌的潜在靶点。