研究背景及意义膀胱癌是全球第二大常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤,发病率仅次于前列腺癌。而在我国,膀胱癌仍是当前泌尿系统最常见的恶性肿瘤,且近年来发病率呈逐渐上升的趋势。膀胱癌的流行病学调查特征显著,其病理学类型多为尿路上皮癌,占90%以上,而鳞状细胞癌或腺癌以及其他类型癌临床少见。同大多数恶性肿瘤一样,影响膀胱癌患者预后的因素很多,如肿瘤的TNM分期、组织学分化程度、浸润深度、转移淋巴结数目和阳性淋巴结比例等;其侵袭、转移和复发是导致膀胱癌患者死亡的主要原因。膀胱癌患者早期多表现为无痛性肉眼血尿或镜下血尿,患者易忽视治疗;若任其发展,则进展迅速,可逐步突破粘膜层至深达肌层,最终发生远处转移,预后较差。因此,能早期查明肿瘤复发转移的原因并探索新的有效的治疗方法,对于临床工作就显得具有特别意义。CD4~+T淋巴细胞是细胞免疫系统的重要组成部分。新的研究证明:CD4~+T淋巴细胞不仅能辅助CD8+细胞毒T细胞,而且还具有协助NK细胞等杀灭肿瘤的作用。虽然膀胱癌免疫研究已取得了一定进展,但目前国内外对膀胱癌组织中CD4~+T淋巴细胞及其亚型含量的表达情况及它们与膀胱癌预后关系的研究目前尚未见正式报道。本研究分为三个部分,第一部分:观察CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞在131例接受经尿道膀胱肿瘤电切手术的非肌层浸润性膀胱癌(non muscle invasive bladder cancer,NMIBC)组织标本中的表达情况,同时对临床、病理学等因素进行相关回顾性分析,探讨CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞在非肌层浸润性膀肮癌组织中的表达情况及其与预后的关系;第二部分:观察CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞在97例肌层浸润性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer,MLBC)组织标本中的表达情况,探讨其与预后的关系,并分别对术前新辅助化疗前后CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞表达的差异分析,探讨化疗对CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞表达的影响,为临床工作中合理选择化疗方案提供理论依据;第三部分:通过采用流式细胞术对45例新鲜膀胱癌组织进行Treg细胞表达、肿瘤增殖指数(proliferation index,PI)、DNA倍体和细胞凋亡率4项指标的检测,探讨它们之间的相关性,从而明确Treg细胞在肿瘤增殖和预后中的作用,对预测膀胱癌的发生、发展及诊断提供帮助。第一部分研究目的:本课题旨在研究CD4~+T淋巴细胞及Treg亚型在非肌层浸润性膀胱癌组织中的表达情况,并探讨它们与预后的相关性。研究方法:本课题共有131例非肌层浸润性膀胱癌患者进入研究,采用免疫组化染色的方法检测CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞在131例非肌层浸润性膀胱癌组织中的分布情况,并用Kaplan-Meier分析方法和Cox比例风险回归模型来评估总生存期(OS)和无复发生存期(RFS),结合临床病理学因素,探讨CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞在非肌层浸润性膀胱癌组织中的表达与预后的相关性。研究结果:通过免疫组化染色法检测发现,CD4~+T淋巴细胞及Treg亚型阳性特征均主要表达于细胞膜,并在非肌层浸润性膀胱癌组织及正常膀胱粘膜上皮组织间均有不同比例的表达。根据尼康Eclipse 80i显微镜下CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞计数数据的平均数(平均值=1,400倍高分辨率)分别把非肌层浸润性膀胱癌患者分成高密度组和低密度组两组。单因素变量分析结果显示,CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞密度和总生存期均成反比例关系(P<0.05),而CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞密度和无复发生存期的预后无关(P>0.05);通过多因素变量分析,肿瘤浸润CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞密度对总生存期来说均是独立的预后因素(P<0.05)。第一部分研究结论:高表达CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞预示着非肌层浸润性膀胱癌患者更短的生存时间,对于此类患者来说,CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞高表达可能是一种潜在的不良预后标志。第二部分研究目的:探讨肌层浸润性膀胱癌患者CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞的表达情况及其与临床辅助化疗及预后的关系。研究方法:我们收集临床工作中收治的97例接受根治性膀胱全切除术患者的临床及病理资料,其中共有37例患者接受了术前新辅助化疗,以及40例患者接受了术后辅助化疗,并应用免疫组化染色法检测其化疗前和/或化疗后肌层浸润性膀胱癌组织中CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞的表达情况,并分析CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞的表达与各临床病理因素之间的相关性,采用生存分析方法,寻找能影响肌层浸润性膀胱癌患者预后的独立因素。研究结果:通过免疫组化染色检测发现,CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞阳性特征均主要表达于细胞膜,表达水平不等。统计学分析显示CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞的表达与患者的年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小等因素无关,均无统计学差异(P值均>0.05)。单因素变量分析结果显示,CD4~+T淋巴细胞密度和总生存期之间差异无统计学意义(P>0.05),而Treg细胞密度、TNM分期、病理学分级以及化疗均和总生存期有关(P值均<0.05)。多因素生存分析结果提示年龄、TNM分期、Treg细胞密度和是否接受化疗均与肌层浸润性膀胱癌患者的预后有关(P<0.05),而性别、肿瘤位置、肿瘤大小等与肌层浸润性膀胱癌患者的预后无关(P>0.05)。此外,研究还发现新辅助化疗能明显降低Treg细胞表达量(P<0.05),而对CD4~+T淋巴细胞来说未见明显差异(P>0.05)。第二部分研究结论:Tre叫细胞密度和积极辅助化疗均可以成为影响肌层浸润性膀胱癌患者预后的独立因素;而术前新辅助化疗能有效降低肌层浸润性膀胱癌患者Treg细胞的表达量,根据Treg细胞密度变化可能成为评判接受化疗是否有效的预测指标之一。第三部分研究目的:探讨膀胱癌患者细胞增殖、凋亡异常情况和Treg细胞表达之间的关系。研究方法:我们收集临床中切除的新鲜膀胱癌组织标本共计45例,采用流式细胞术对其进行了 Treg细胞表达、肿瘤增殖指数(PI)、DNA倍体和细胞凋亡率等指标的检测,并探讨它们之间的相关性,从而明确Treg细胞在预测肿瘤发生、发展和预后中的作用。研究结果:通过流式细胞术检测发现,膀胱癌组中异倍体肿瘤高表达(75.56%);Treg细胞表达和DI值均与膀胱癌的分化程度、临床分期有密切关系(P<0.05);而PI与膀胱癌患者的倍体类型、分化程度、临床分期均有密切关系(P<0.05);细胞凋亡率与膀胱癌的倍体类型、临床分期之间有密切关系(P<0.05)。随着Treg细胞表达逐渐升高,DI值、PI值均不断升高,其与DI值、PI值均呈正相关(r=0.567,r=0.843,P<0.05),而凋亡率与Treg细胞表达呈负相关(r =-0.8502,P<0.05)。第三部分研究结论:膀胱癌组织中细胞增殖和凋亡均表现异常,并和Treg细胞表达具有相关性,提示Treg细胞表达在膀胱癌的发生、发展和预后中具有重要的作用。本课题的研究结论:在膀胱癌组织中可检测到CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞的表达,CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞密度对非肌层浸润性膀胱癌患者的临床预后有一定的预测价值:高表达CD4~+T淋巴细胞、Treg细胞均能提示差的临床预后;对于肌层浸润性膀胱癌患者来讲,CD4~+T淋巴细胞的表达与临床预后关系不确定,但高表达Treg细胞仍和患者预后差有关,并且根据化疗前后Treg细胞密度变化可能成为评判接受化疗是否有效的预测指标;流式细胞术证实膀胱癌组织中Treg细胞表达和癌细胞增殖和凋亡等均具有相关性,提示Treg细胞表达在膀胱癌的发生、发展和预后中具有重要的作用。