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目的:中枢神经损伤后再生障碍的主要原因是由于髓磷脂抑制分子的存在,目前证实存在的抑制分子有Nogo-A、髓鞘相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)、少突胶质细胞-髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein,OMgp),NgR是一种神经元轴突表面蛋白,是三种抑制蛋白的共同受体,与p75(neurotrophin p75 receptor),LINGO-1或TROY形成受体复合物,是抑制信号向神经元胞内传导的关键节点,因此,预测将其阻断有可能促进中枢神经损伤后轴突的再生。本课题的目的是在于利用NgR特异性RNAi(RNA interference RNA干扰)的重组腺病毒载体,转染离体海马脑片缺血再灌注模型,观察NgR基因沉默对中枢神经缺血性损伤后轴突再生的影响,阐明NgR在中枢神经(central nervous system,CNS)轴突再生障碍信号转导途径中的重要作用,以期为临床脑缺血后神经康复的基因治疗奠定基础。方法:1.离体培养9-11天Sprague-Dawley(SD)大鼠海马脑片,制备缺血再灌注模型;2.构建NgR特异性RNAi的重组腺病毒载体AD-shRNA-NgR,转染海马脑片,通过RT-PCR检测NgR mRNA基因沉默情况,筛选最佳干扰片段;3. AD-shRNA-NgR转染海马脑片48h后,糖氧剥夺30min,分别在复氧24h,72h,5d三个时段,应用RT-PCR检测NgR mRNA表达,同时检测缺血再灌注组NgR mRNA的时相表达,观察海马脑片缺血再灌注后NgR的表达变化、RNAi对NgR的抑制效率及抑制效率的维持;再设立正常对照组、缺血再灌注组及RNAi干预组,在缺血再灌注后48h检测指标,应用Western blotting及免疫组化检测NgR蛋白表达,氯化金染色法观察轴突再生情况,探讨NgR对中枢神经缺血性损伤后轴突再生的影响。结果:1.腺病毒对海马脑片的感染效率及最佳干扰片段的筛选:腺病毒以1.0×109pfu的病毒量感染海马脑片时,感染效率粗测在90%以上;RT-PCR结果显示:三条干扰片段以shRNA-NgR-2基因沉默效率最高,感染48h后抑制率达到69%;2.RT-PCR检测NgR mRNA表达结果显示:缺血再灌注后NgR基因表达各时相均明显增高(p﹤0.05),72h表达回落(同24h相比p﹤0.01),于5d时又有增高,但未达到24h水平(同24h相比p﹤0.05),总体呈波动性变化;RNAi干预组较缺血再灌注组NgR mRNA基因表达明显减弱(p﹤0.01),抑制效率于5d时降低(p﹤0.05),但总体维持在较高水平;Western blotting及免疫组化检测NgR蛋白表达结果显示:缺血再灌注组NgR蛋白表达明显增高(p﹤0.01),RNAi干预组较缺血再灌注组NgR基因表达明显减弱(p﹤0.01),但未至正常水平(p﹤0.05);氯化金染色法观察轴突再生情况发现:缺血再灌注组轴突长度较正常对照组明显缩短(p﹤0.01),RNAi干预组较缺血再灌注组轴突有明显增长(p﹤0.01),但未达到正常水平(p﹤0.05)。NgR表达同轴突再生呈直线负相关(r=-0.798,p﹤0.01)。结论:1.本实验所培养离体海马脑片培养期间可保持正常的形态结构;建立的海马脑片缺血再灌注模型稳定、成功,可方便有效的模拟在体脑缺血性损伤。2.成功构建了NgR特异性shRNA重组腺病毒载体,并成功筛选出有效干扰片段。3.海马脑片缺血再灌注后NgR表达明显增高,24h达到高峰,之后开始下降,72h后又有上升趋势,总体呈波动性变化。4.腺病毒能高效、低毒感染海马脑片,有效进行NgR特异性shRNA基因转导;腺病毒介导RNAi可有效、稳定地抑制海马脑片NgR mRNA及蛋白表达。5.腺病毒介导RNAi沉默NgR基因可促进海马缺血再灌注后神经轴突的再生。