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目的:研究多巴胺D2样受体激动剂对多巴胺能细胞自噬水平和α-synuclein等易聚集蛋白降解的调控及其分子机制。方法:离体实验以多种多巴胺能细胞株如PC12、MES23.5、SH-SY5Y和原代培养的大鼠中脑神经元为工具细胞,其中PC12细胞为主要研究对象;以多巴胺受体激动剂普拉克索和喹吡罗,以及多巴胺D2、D3受体特异性拮抗剂为工具药;Western Blot检测各种蛋白的表达或磷酸化水平的变化;用维甲酸(RA)联合佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(TPA)诱导SH-SY5Y细胞分化;普通和定量PCR检测不同细胞内D2样受体和BECN1的m RNA水平变化;CCK-8检测细胞活力,以cleaved caspase-3蛋白表达水平变化评价细胞凋亡情况;激光共聚焦观察细胞内EGFP-LC3、GFP-RFP-LC3点状聚集和多巴胺D2、D3亚型受体的定位和分布情况;透射电镜观察细胞内自噬小体的形成情况;钙成像仪动态监测细胞内游离钙离子水平;瞬时转染技术干扰和过表达Beclin 1以及c-Fos;免疫共沉淀(Co-IP)观察Beclin 1和Ptd Ins3K蛋白相互作用情况;染色质免疫共沉淀(Ch IP)观察c-Fos蛋白和BECN1启动子的结合情况;荧光素酶双标实验检测BECN1启动子的活性;以携带WT和A53T、A30P突变型SNCA的慢病毒感染PC12细胞诱导α-synuclein过表达;以携带Htt-552-18Q、Htt-552-100Q的腺病毒感染PC12细胞诱导Htt-552蛋白过表达。在体以15月龄的野生型和A53T-SNCA转基因小鼠为研究对象;以腹腔注射0.5 mg/kg的普拉克索,每天注射两次,持续3周给药,用等体积的生理盐水作为阴性对照组。3周后,分离黑质和纹状体组织,用常规western blotting检测各蛋白的表达变化。结果:1.多巴胺细胞中多巴胺D2样受体的表达情况:PC12细胞主要表达多巴胺D2受体,MES23.5细胞上同时表达多巴胺D2及D3受体,低分化的SH-SY5Y细胞上很少表达多巴胺D2受体,D3受体几乎不表达,RA/TPA诱导SH-SY5Y细胞分化后多巴胺D2受体表达有所增加,D3受体则明显增加。2.D2样受体激动剂对细胞自噬水平及存活的影响:1)与对照组相比,多巴胺D2样受体激动剂普拉克索在一定剂量范围内(10-100μM)呈浓度和时间依赖性地促使PC12、MES23.5和诱导分化的SH-SY5Y细胞内LC3-II和Beclin 1蛋白表达增加、而P62蛋白水平明显下降;喹吡罗(另一个经典的多巴胺D2样受体激动剂)作用于PC12细胞后也观察到类似的现象;而普拉克索右旋对映体(几乎无多巴胺D2样受体激动活性)作用于PC12细胞未观察到上述蛋白水平的变化。普拉克索(100μM)作用于未分化的SH-SY5Y(多巴胺D2样受体表达较低)也未观察到上述蛋白水平的变化;巴弗洛霉素A1(抑制自噬体和溶酶体融合)和氯喹(抑制溶酶体酶活性)存在时,普拉克索和喹吡罗仍然可以增加LC3-II水平;上述两个多巴胺D2样受体激动剂作用于PC12细胞后,LAMP1和LAMP2蛋白水平均无变化。2)免疫荧光观察到普拉克索作用的PC12细胞内EGFP-LC3点状聚集明显增加,转染RFP-GFP-LC3的PC12细胞内GFP、RFP点状聚集均显著增加,而且RFP点状聚集增加更为明显;3)原代培养的大鼠中脑神经元中,普拉克索作用后LC3荧光点状聚集明显增多;4)透射电镜观察到普拉克索及喹吡罗处理12 h后PC12细胞内自噬小体形成明显增多;5)特异性多巴胺D2,D3受体抑制剂存在时,普拉克索不能促使多巴胺能细胞中上述自噬相关蛋白水平改变。6)在上述研究使用的剂量范围内(普拉克索不高于100μM、喹吡罗不高于10μM),这些D2样受体激动剂作用24 h,PC12细胞活力并没有明显变化,也未发生明显凋亡。上述结果充分表明,以普拉克索为代表的多巴胺D2样受体激动剂可以诱导并增加多巴胺细胞内的自噬水平,且在一定浓度范围内对多巴胺能细胞活力没有明显影响。3.相关机制研究结果:普拉克索作用于PC12细胞后引起:1)c-Fos蛋白表达随时间依赖性增加;2)p-Ca MKIV(Thr 196)和p-CREB(S133)的磷酸化水平明显增加;3)p-JNK(Thr183/Tyr185)和p-c-Jun(S63)的磷酸化水平及c-jun总蛋白水平没有明显变化;4)普拉克索和喹吡罗未能下调p-m TOR(S2248),p-p70S6K(Thr389)及p-ULK1(S757)位点的磷酸化水平及上调p-ULK1(S555)的磷酸化水平;与经典的饥饿诱导的自噬(使PC12细胞处于EBSS溶液中)相比,相反在30 min到1 h普拉克索能显著上调p-m TOR(S2248)和p-p70S6K(Thr389)及p-ULK1(S757)的磷酸化水平;5)BECN1 m RNA水平随普拉克索浓度增加而增加;免疫共沉淀(Co-IP)发现普拉克索及喹吡罗作用后Beclin 1和Ptd Ins3K蛋白结合明显增加;6)普拉克索促进PC12细胞内游离钙离子水平增加,去除细胞内钙离子后,普拉克索无法使c-Fos、Beclin 1和LC3-II蛋白水平增加;7)BECN1基因沉默后,普拉克索并不能使LC3-II增加;Beclin 1蛋白过表达,LC3-II水平明显增加;8)c-Fos基因沉默后,Beclin 1和LC3-II均无明显增加;而c-Fos过表达,Beclin 1和LC3-II均明显增加;9)染色质免疫共沉淀(Ch IP)结果显示c-Fos可与BECN1上游类似经典的AP-1(5’-TGCCTCA-3)位点结合;10)荧光素酶双标实验发现普拉克索可使BECN1启动子活性增加,这个AP-1位点缺失突变后则无法增加。4.普拉克索对易聚集蛋白的降解作用结果:1)普拉克索可促进鱼藤酮处理后正常及过表达WT、A53T和A30P-SNCA的PC12细胞内α-synuclein蛋白的降解;2)腹腔注射普拉克索对正常及A53T-SNCA小鼠黑质及纹状体内自噬水平有增高趋势,且α-synuclein蛋白蓄积有一定程度的减少;3)普拉克索可促进Htt-552-18Q和Htt-552-100Q蛋白降解。结论:多巴胺D2样受体激动可通过促进自噬活性清除α-synuclein及亨廷顿蛋白,其促进自噬的机制与多巴胺D2/D3受体依赖的、钙离子介导的c-Fos/Beclin 1信号通路的激活有关。