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目的:相关研究已表明慢性无机砷暴露能导致人和大鼠肝脏损伤与肝纤维化的发生。肝星状细胞作为胶原纤维的主要来源,其激活是形成肝纤维化的关键因素。NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体是炎症小体家族中最经典的成员,已被广泛研究,且与肝纤维化形成和肝星状细胞活化密切相关。本课题组之前的研究已经证实,无机砷暴露能诱导小鼠非酒精性脂肪性肝病的发生和肝星状细胞的活化,但肝纤维化表现尚不明显。此外,本课题组之前的研究也表明无机砷暴露能激活小鼠肝脏内NLRP3炎症小体,同时上调肝脏自噬水平。但是在无机砷诱导的肝纤维化过程中,自噬水平的改变与NLRP3炎症小体激活对于肝星状细胞活化的作用尚不明确。因此,本研究的目的是探究在亚砷酸钠诱导Sprague-Dawley大鼠肝纤维化过程中,NLRP3炎症小体对肝星状细胞活化的作用及其机制,以及自噬在其中所起到的调控作用。方法:在体内实验中,利用10周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠作为研究对象,随机分为3组,包括对照组,2.5 mg/kg BW处理组和5 mg/kg BW处理组。暴露方式采取灌胃染毒亚砷酸钠,12 h/次,暴露时间为9个月,染毒期间大鼠自由饮食饮水。暴露结束后处死大鼠,收集肝脏组织并制作石蜡切片以进行实验研究。通过苏木素-伊红染色法(H&E染色)检测大鼠肝脏炎症损伤情况;通过天狼星红染色法和马松染色法检测大鼠肝脏纤维化病理表现;用谷丙转氨酶(ALT)检测试剂盒检测血清谷丙转氨酶含量;用谷草转氨酶(AST)检测试剂盒检测血清谷草转氨酶含量;通过组织免疫荧光法检测肝星状细胞激活标志蛋白?平滑肌肌动蛋白(?-SMA)的表达水平;通过免疫蛋白印迹法(Western blot)检测大鼠肝组织中肝星状细胞活化相关标志蛋白表达水平:Ⅰ型胶原蛋白(Collagen-1)、?-SMA、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1),NLRP3炎症小体及其下游相关蛋白表达水平:NLRP3、caspase-1前体(pro-caspase-1)、包含caspase募集结构域凋亡相关斑点蛋白(ASC)、caspase-1、白介素-1?前体(pro-IL-1?)和白介素-1?(IL-1?),自噬相关蛋白表达水平:微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)和p62,以及细胞浆中组织蛋白酶B(CTSB)的表达水平。体外实验中,以大鼠肝星状细胞系HSC-t6和大鼠的原代肝星状细胞为研究对象。梯度浓度的亚砷酸钠处理HSC-t6之后通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞存活率;用0,1,2,4?M亚砷酸钠处理HSC-t6细胞24 h,通过Western blot法检测HSC-t6细胞中自噬相关蛋白表达水平:LC3-Ⅱ和p62,细胞浆中CTSB表达水平;脂多糖(LPS)预处理后用0,1,2,4?M亚砷酸钠处理HSC-t6细胞24h,通过Western blot法检测HSC-t6细胞中NLRP3炎症小体及其下游相关蛋白表达水平:NLRP3,caspase-1 p20和IL-1?,肝星状细胞活化相关标志蛋白表达水平:?-SMA、Collagen-1、MMP-1和TIMP-1;预先使用NLRP3的特异性抑制剂(MCC950),CTSB释放抑制剂(CA-074 me)和自噬特异性抑制剂(3-MA)处理HSC-t6细胞和大鼠原代肝星状细胞后,用4?M亚砷酸钠处理HSC-t6细胞24 h。通过Western blot法检测HSC-t6细胞活化状态、NLRP3炎症小体激活程度和细胞浆中的CTSB水平;通过免疫荧光检测原代肝星状细胞活化状态和HSC-t6细胞CTSB释放水平;通过吖啶橙(AO)荧光探针检测HSC-t6细胞溶酶体损伤程度。结果:体内实验中,大鼠暴露于0 mg/kg BW,2.5 mg/kg BW和5 mg/kg BW亚砷酸钠9个月后,H&E染色、血清ALT和AST检测结果显示与对照组相比,亚砷酸钠高浓度染毒组的大鼠肝脏炎症损伤明显;天狼星红染色和马松染色结果显示与对照组相比,亚砷酸钠染毒组的大鼠肝脏出现大量胶原沉积,提示肝纤维化形成;组织免疫荧光结果显示与对照组相比,亚砷酸钠染毒组的肝星状细胞活化标志蛋白?-SMA的表达水平升高;Western blot结果显示与对照组相比,亚砷酸钠染毒组的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达水平升高,p62的表达水平减少;细胞浆中CTSB的表达水平升高;NLRP3炎症小体及其下游相关蛋白NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1?和IL-1?的表达水平升高;肝星状细胞活化相关标志蛋白Collagen-1、?-SMA和TIMP-1的表达水平升高,MMP-1表达水平减少。体外实验中,MTT结果显示:用不同浓度的亚砷酸钠处理HSC-t6细胞24 h,随着亚砷酸钠浓度的增加细胞存活率逐渐降低;用0,1,2,4?M亚砷酸钠处理HSC-t6细胞24 h,Western blot结果显示:与对照组相比,染毒组LC3-Ⅱ、胞浆CTSB、NLRP3、caspase-1 p20、IL-1?、Collagen-1、?-SMA和TIMP-1表达水平升高,p62和MMP-1表达水平减少。应用NLRP3的特异性抑制剂MCC950预处理后,对于HSC-t6细胞,Western blot结果显示,与染毒组(4?M亚砷酸钠)相比,抑制剂预处理组caspase-1 p20、IL-1?、Collagen-1、?-SMA和TIMP-1的表达水平减少,MMP-1表达水平升高;对于大鼠原代肝星状细胞细胞,免疫荧光结果显示,与高剂量暴露组(5 mg/kg BW)相比,抑制剂处理组的?-SMA表达水平减少。应用CTSB释放抑制剂CA-074 me预处理后,对于HSC-t6细胞,Western blot结果显示:与染毒组相比,抑制剂预处理组NLRP3、caspase-1 p20、IL-1?、Collagen-1、?-SMA和TIMP-1的表达水平减少,MMP-1表达水平升高;细胞免疫荧光结果显示:与染毒组相比,抑制剂预处理组CTSB释放减少;对于大鼠原代肝星状细胞细胞,免疫荧光结果显示:与高剂量暴露组相比,抑制剂处理组的?-SMA表达水平减少。应用自噬特异性抑制剂3-MA预处理后,对于HSC-t6细胞,Western blot结果显示:与染毒组相比,抑制剂预处理组NLRP3、caspase-1 p20、IL-1?、胞浆CTSB、Collagen-1、?-SMA和TIMP-1的表达水平减少,MMP-1表达水平升高;细胞免疫荧光结果显示:与染毒组相比,抑制剂处理组CTSB释放减少;AO荧光探针结果显示:与染毒组相比,抑制剂预处理组溶酶体损伤程度减弱;对于大鼠原代肝星状细胞细胞,免疫荧光结果显示,与高剂量暴露组相比抑制剂处理组的?-SMA表达水平减少。结论:亚砷酸钠通过自噬-CTSB-NLRP3炎症小体通路诱导肝星状细胞活化,促进肝纤维化的形成。