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近期的研究发现，急性脑梗塞、癫痫、MDS等神经系统病变均能观察到细胞凋亡。急性颅脑损伤后，除了当时直接造成的神经损伤外，外伤后脑内还出现继发性的神经损伤，凋亡在外伤性颅脑损伤后继发性神经损伤起重要作用。本实验室研究表明，在外伤性颅脑损伤72h后神经细胞凋亡达到高峰。caspase-3，又称半胱氨酸蛋白酶32(cysteine protease P32(CPP32))，是凋亡过程中重要的蛋白酶，是多种死亡受体介导凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。有研究亦证实，caspase-3的表达激活在外伤性颅脑损伤、脑缺血后神经细胞凋亡及功能改变中起重要作用。提示如何抑制caspase-3的活化及活性必将为脑损伤提供一种新的有效的治疗方法。 本实验选用雄性SD大鼠随机分为假手术组、生理盐水组、caspase-3抑制剂组。采用改进的Feeney自由落体脑损伤装置进行致伤打击，致伤冲击力为50g×16cm，造成中型外伤性颅脑损伤模型；损伤前后各30min于右侧脑室注射z-DEVD-fmk，72h后，断头取脑，用干湿法测量脑含水量，Annexin-V FITC／PI流式细胞检测神经细胞凋亡，硝酸还原酶法脑组织中NO含量，石蜡切片HE染色及透射电镜观察组织、细胞结构变化。阐明caspase-3抑制剂对颅脑损伤后神经细胞凋亡、脑水肿、及脑组织NO含量的影响，进一步探讨caspase-3抑制剂治浙江大学硕士研究生学位论文序颅脑损伤的机理，从而指导临床治疗，提高颅脑损伤的治愈率、降低死亡率和致残率。 材料与方法 1、动物分组:将雄性SD大鼠称重后随机分为假手术组、生理盐水组、casPase一3抑制剂组，每组为12只。3组间体重方差检验没有显著性差别(P>。.05)。 2、模型制作:大鼠称重后，盐酸氯氨酮(40mg/kg)腹腔注射麻醉，置于乞体定位仪上，固定头部，额顶部去毛，头皮碘酒、酒精消毒，矢状切开头皮，暴露右顶骨，用牙科磨钻在冠状缝后Znlrn，中线旁Zmm处钻一直径4一smm骨窗。在同一骨窗里，用与25ul微量注射器连接的穿刺针穿刺右侧脑室，坐标:八P o.smrn，LAT l.smm，DEP4.srnm，灌注速度为Zul/min，生理盐水组灌注生理盐水IOul，easpase一3抑制剂组灌注z一DEVD一fmk IOul(o.sug/ul)，留针lomin。刃min后.采用改良的Feeney自由落体损伤装置进行打击，用509重的击锤从16cm处自由坠落冲击撞杆造成严重的脑挫裂伤，打击深度3mm，硬膜保持完整。30min后，在同一坐标，灌注速度为Zul/min，生理盐水组灌注生理盐水1 oul，casPase一3抑制剂组灌注z一DEVD币nk 10ul(0.sug/ul)，留针10min。拔针后，脑耳胶封闭硬膜针眼，牙托粉封闭骨窗，缝合头皮。假手术组，开骨窗后，牙托粉封闭骨窗，缝合头皮。 3、动物及标本处理:大鼠外伤性颅脑损伤72h后，盐酸氯氨酮(40mg/kg)腹腔注射麻醉，断头处死，在冰盘上快速取全脑，O℃PBS缓冲液清洗，滤纸吸干。沿冠状切面，将脑切为Zmm脑片。将一含损伤区脑片用10%福尔马林液固定，送浙二病理科，石蜡包埋切片并HE染色。取损伤周围lmm左右，粟米大小，2.5%戊二醛固定，送浙大医学院形态中心电镜观察。取损伤周围lmm左右及对侧相应部位脑组织各约巧mg，用干湿重比法测量分别测脑含水量。取损伤周围lmm左右脑组织约巧mg，制单细胞悬液，FcM检测凋亡。取另一脑片，称重后，一80℃保存，待检测脑组织NO含量。 干湿比重法测定:用万分之一光电分析天平分别精确称重并记录，然后置浙江大学硕士研究生学位论文于100’C烤箱中24h，烤至衡重后再依次称重，算出脑组织的湿重、干重，用(湿重一干重)令湿重X 100%来表示脑组织含水量。 制单细胞悬液及FCM(flow cytometry)检测凋亡:取新鲜脑组织约1 smg，放仪oOC PBS缓冲液约o.sml，用眼科剪将脑组织剪成为0.1~3左右组织碎片，lml移液器吹打15次，180目滤网OOC PBS冲洗过滤，收集滤液，300目滤网再次OOC}〕BS冲洗过滤，收集滤液。滤液用ooC PBS稀释至sml，IO00r/min离心smin，弃上清。oOC PBS清洗2次(重悬至sml，IO00r/min离心smin，弃上清)。细胞计数后，按FCM操作步骤及rh一Annexin一V FITC/PI kit说明，检测细胞凋亡。 脑组织NO含量测定:脑组织准确称重，置于Eppendor药彗，按重量体积比为1:4加OOC PBS，将E即endor暗置于碎冰内，用超声细胞粉碎机制成20%组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清液，按蛋白定量(双缩脉法)测试盒说明检测蛋白含量，按一氧化氮(NO)测试盒说明检测NO含量，单位为umol/gprot。 病理切片观察:石蜡包埋切片常规HE染色，观察皮质神经元损伤情况。 电镜观察:2.5%戊二醛固定，4℃避光保存，2%饿酸处理，乙醇系列脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铀铅双染色，透射电子显微镜观察。 4、统计学处理:所有的数据都采用带有spss/20.0的eompaq pentium 111‘1000计算机进行分析，结果以(社:)和95%可信区间表示，采用单向方差分析，定尸<0.05为显著性差异。 结果 CasPase一3抑制剂对大鼠外伤性颅脑损伤72h后细胞凋亡的影响