论文部分内容阅读
背景:目前,在中国肺癌是发病率和死亡率位居第一的恶性肿瘤。针对晚期的非小细胞肺癌(NSCLC)治疗,分子靶向治疗成为研究热点,其中以EML4-ALK融合基为靶点的靶向治疗尤其备受关注。另外,众多科学家研究发现一种新的抑癌基因TGFβRII。大量研究表明,TGFβRII与多数恶性肿瘤发生发展密切相关,有研究发现,TGFβRII在肠癌、头颈癌等恶性肿瘤中表达异常增高,但也有研究发现TGFβRII在胃癌、结直肠癌、肝癌、口腔鳞状细胞癌、宫颈癌等癌症中异常降低并促进癌症发展。TGFβRII是TGF-β蛋白主要结合受体蛋白,在细胞增殖过程中发挥重要作用,可进一步使TGFβR1磷酸化激活TGFβR1上下游相关通路,调节机体细胞正常生长凋亡。当TGFβ信号通路异常,机体内发生多种癌症危险性将大大升高。TGFβRII基因表达异常在直接影响TGFβ信号通路失调之外,还可影响Smad等信号通路、Smad信号通路在细胞内发挥重要的调节DNA转录功能,一旦受到影响,将激活或抑制某些基因表达从而影响细胞增殖凋亡。除此之外,TGFβRII作用可能还与Ras信号通路有关。研究发现,Ras信号通路可能介导TGFβRII表达下调,这是癌症进展的可能发生机制。另外,TGFβRII表达还与某些非编码单链RNA分子(microRNA)表达有关,miR-370、miR-590-5p等可通过靶向下调TGFβRII表达分别促进胃癌、肝癌肿瘤细胞增殖侵袭。另有研究发现,TGFβRII信号通路在癌症早期可抑制肿瘤细胞增殖分化,而后期则会因各种原因减弱或失去癌症细胞增殖的抑制作用,并发生肿瘤细胞迁移的促进作用。另外,研究发现TGFβRII表达异常促使肿瘤组织表现细胞的异常分化、细胞核扩大和大量有丝分裂、炎症和血管生成等特征。血管生成是肿瘤进展的重要病理特征,已有研究发现TGFβRII在血管生成过程中扮演重要角色,其可以直接调节参与血管形成的效应分子的表达,与Smad4和Notch信号通路共同调节黏附分子N-cadherin的转录,影响内皮细胞及其周细胞的黏附作用,从而影响血管的成熟与稳定。多数研究表明癌症组织TGFβRII表达与正常组织比较有明显差异,且TGFβRII表达变化与癌症临床分期有显著统计学意义。我们通过筛选EML4-ALK融合基因表达阳性患者后,分析不同分期EML4-ALK融合基因阳性肺腺癌患者临床特征,验证TGFβRII在EML4-ALK融合基因阳性不同分期临床肺腺癌样本中的表达水平,以及TGFβRII对肺腺癌H3122细胞生物学行为的影响,利用这些结果证明TGFβRII对EML4-ALK融合基因表达阳性肺腺癌影响,了解TGFβRII在不同分期EML4-ALK融合基因表达阳性肺腺癌中的临床意义,并对TGFβRII进行肺腺癌临床治疗指导策略。方法:本研究分为两部分。第一部分为临床病理研究,我们从广州医科大学附属第一医院收集自2008年12月至2013年12月期间共484例肺腺癌患者经手术切除的石蜡包埋肿瘤组织样本。通过免疫组化(SP)对病理组织中ALK进行免疫染色,和通过实时荧光定量PCR(qPCR)对病理组织样本中ALK mRNA检测定量,从而鉴定出临床肺腺癌患者的石蜡组织样本中EML4-ALK融合基因分型。分型后筛选出ALK表达阳性的患者肿瘤组织石蜡样本,对其不同临床分期进行分组。整理临床资料,分析不同分期EML4-ALK阳性肺腺癌患者临床病理特征并通过qPCR技术检测TGFβRII在IA期、IIIA期EML4-ALK融合基因阳性样本中的表达水平。第二部分为体外细胞研究,实验分为两个小组,LV-shRNA-TGFβRII细胞组,和LV-shRNA-GP细胞组。构建稳定表达细胞株后,运用Transwell验证TGFβRII对肺腺癌H3122细胞侵袭的影响。统计学分析利用SPSS 22.0统计软件,以单因素方差分析结果,用t检验作统计学处理,P值<0.05认为有统计学意义。结果:第一部分临床病理研究中:免疫组化以及qPCR检测肺腺癌患者切除的病理组织蜡块结果显示484例肺腺癌患者中,ALK表达阳性患者共28例(5.85%),其中IA期11例,IIIA期9例。分析IA期、IIIA期EML4-ALK融合基因阳性患者临床病理特征,IA期和IIIA期小于60岁患者分别为5例、6例,大于或等于60岁患者分别为6例、3例,吸烟者分别为3例、5例,不吸烟者分别为8例、4例,两者在年龄、吸烟方面统计学上无差异(P>0.05);对该20例样本进行qPCR检测,结果显示ⅠA期EML4-ALK阳性肺腺癌组织中TGFβRⅡmRNA相对表达量明显高于ⅢA期;第二部分体外细胞研究中:成功构建LV-shRNA-TGFβRII/H3122细胞克隆,TGFβRII的沉默效率为85.97%;LV-shRNA-TGFβRII-H3122细胞组通过Transwell的细胞数多于LV-shRNA-GP-H3122细胞组(P<0.05)。结论:EML4-ALK融合基因阳性不同分期肺癌组织中TGFβRII表达具有明显差异。EML4-ALK阳性肺腺癌中晚期肿瘤组织TGFβRIImRNA表达水平明显低于早期肿瘤组织,沉默TGFβR II基因后ALK阳性肺腺癌细胞侵袭性明显增强,TGFβR II低表达将促进EML4-ALK融合基因阳性肺腺癌患者发病进程。