目的:各种原因导致的骨缺损非常常见,严重的影响了患者的生活质量,而骨创愈合是极其复杂的生物学修复过程,也一直是临床上的一大难题,如何促进骨缺损修复愈合是医学研究的焦点和热点。多年以来,国内外学者借助组织学、组织化学组织形态计量学,超微结构与生物力学等手段对骨创愈合进行了大量的实验观察,对骨创愈合机制也进行了广泛的探讨。淫羊藿苷主要来源于淫羊藿中药,是补骨壮阳的中药提取物,中药淫羊藿性味辛、甘、温,归肝、肾经,具有补肾阳,强筋骨,祛风湿等功能。大量研究证实,淫羊藿苷可以诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,从而增加骨细胞活性,以达到促进骨愈合的目的。富自体浓缩生长因子(Concentrated Growth Factors,CGF)是新一代的血浆提取物,含有大量的纤维蛋白以及高浓度的多种生长因子,能够促进软组织快速愈合,减少术后瘢痕形成,并且可以单独或联合其他生物材料注入硬组织缺损处,从而修补缺损,诱导生长,加速局部创伤的愈合,提高愈合质量。本研究通过建立兔颅骨缺损模型,分别通过淫羊藿苷灌胃全身用药、CGF纤维蛋白凝胶膜覆盖颅骨缺损面,在不同时间点采用大体观察、X线观察、组织学观察、骨组织形态计量学研究,探讨淫羊藿苷、CGF促进骨缺损的诱导作用,采用兔全基因组芯片分析淫羊藿苷、CGF对促进兔颅骨缺损修复过程中基因表达谱差异。采用Real-Time PCR和Western blot分析的方法探讨淫羊藿苷、CGF促进兔颅骨缺损修复主要信号诱导通路。方法:第一部分淫羊藿苷及富自体浓缩生长因子促进兔颅骨缺损修复形态学观察1动物及分组:72只新西兰大白兔,12周龄,体重1.8kg~2.0 kg。随机分为对照组、淫羊藿苷组和CGF组,每组24只,编号,分笼饲养。对照组:造兔颅骨缺损后,紧密缝合骨膜及皮肤,不做任何干预措施,待其骨缺损自然愈合。术后第一天开始,每天一次在进食前按1ml/kg定量生理盐水灌胃;淫羊藿苷组:造兔颅骨缺损后,紧密缝合骨膜及皮肤,淫羊藿苷中药全身用药。术后第一天开始,每天按等剂量淫羊藿苷中药灌胃;CGF组:造兔颅骨缺损后,制取CGF纤维蛋白凝胶膜覆盖充填在局部骨缺损处,分层紧密缝合骨膜及皮肤,关闭创面。2手术实验过程:按照实验动物分组,10%水合氯醛全麻下手术造直径15mm兔颅骨缺损。对照组术后第一天开始每日按照1ml/kg给予定量生理盐水灌胃,淫羊藿苷组术后第一天开始每日给予等剂量淫羊藿苷灌胃,CGF组术中给予CGF纤维蛋白凝胶膜覆盖颅骨缺损区,术后自由取食水。分别于术后2周、4周、8周、12周处死动物,无菌条件下切取缺损区新生组织标本,进行大体观察并拍摄X线片以观察颅骨缺损区愈合情况。3组织学观察:骨组织脱矿制作组织切片,进行HE染色、免疫组化,观察兔颅骨缺损区骨修复愈合情况。4骨计量学观察:镜下观察三种方法对缺损新生组织区破骨细胞和成骨细胞的数量和特点的影响,骨小梁平均宽度和面积,以及在不同愈合阶段对成骨速度和新生骨质量的影响。5统计分析:采用方差分析各组间骨计量学指标之间差异。P<0.05时认为具有统计学意义。第二部分淫羊藿苷及富自体浓缩生长因子促进兔颅骨缺损修复的基因表达谱差异分析1实验动物分组,动物实验,动物给药同第一部分。2总RNA提取及纯化:三组动物分别于术后2、4周处死,无菌条件下截取缺损区新生组织,液氮环境中研磨,提取并纯化总RNA。并测定总RNA浓度、纯度及完整性。3 Affymetrix全基因组m RNA表达谱芯片实验。4生物信息软件分析:采用Robust Multichip Analysis(RMA)归一化方法处理分析,三组间两两对比筛选差异基因,选择上调大于2倍的基因和下调大于2倍的基因,并进行代谢途径pathway分析。第三部分淫羊藿苷及富自体浓缩生长因子促进兔颅骨缺损修复的主要信号传导通路的探讨1动物分组,动物实验同第一部分2颅骨缺损区新生组织m RNA提取、纯化同第二部分3将第二部分实验筛选出的淫羊藿苷组与对照组对比差异基因HGF和CGF组与对照组对比差异基因Runx2上下游引物由上海生工分别合成。4利用M-MLV反转录酶变性RNA和引物,并加入反应液,合成c DNA第一链。5 Real-Time PCR,以上述合成c DNA第一链为模板,通过Real-Time PCR扩增,以2-(△Ctsample-△Ctcontrol)法进行计算,去检测淫羊藿苷组与对照组HGF m RNA表达情况、检测CGF组与对照组Runx2 m RNA表达情况。6提取颅骨缺损区新生组织蛋白,通过Western blot分析检测淫羊藿苷组与对照组HGF蛋白表达情况、CGF组与对照组Runx2蛋白表达情况。结果:第一部分淫羊藿苷及富自体浓缩生长因子促进兔颅骨缺损修复形态学观察1实验动物大体观察术后2周,淫羊藿苷组,CGF组和对照组中央为纤维结缔组织充填,局部凹陷,质松软,薄且呈半透明状。组间无明显差别;术后4周,淫羊藿苷组,CGF组兔颅骨缺损区周围可见少量新骨生长,质松软,薄且呈半透明状,中央部分为纤维结缔组织充填。对照组骨缺损区未见明显新骨形成;术后8周淫羊藿苷组,CGF组兔颅骨缺损区都被均匀的硬组织所覆盖,与周边正常骨组织有明显骨融合现象。对照组兔颅骨缺损区有少量骨痂形成,与周边正常骨组织无明显骨融合现象;术后12周,淫羊藿苷组,CGF组兔颅骨缺损区均可见新形成的骨组织覆盖,色红,质硬,与边缘无明显界限,与周围正常骨组织融合完好。对照组颅骨缺损区表面及周边部骨痂形成,部分中央区未完全形成骨质,无正常颅骨生理弧度。2 X线观察术后2周,淫羊藿苷组,CGF组和对照组兔颅骨缺损处为均匀低密度影像;术后4周,淫羊藿苷组兔颅骨缺损处为云雾状低密度阴影,骨缺损边缘略模糊,CGF组兔颅骨缺损处为云雾状低密度阴影,缺损区范围略变小,骨缺损边缘略模糊,对照组缺损处为均匀低密度影像;术后8周,淫羊藿苷组,CGF组兔颅骨缺损区内可见局部有高密度骨形成,缺损区范围明显变小,骨缺损边缘模糊,对照组缺损区域密度低于周围正常骨组织,与正常组织间界限明显;术后12周,淫羊藿苷组和CGF组兔颅骨缺损区域内密度与周围无明显界限,密度基本一致,两组无明显差别,对照组兔颅骨缺损区域部分区域仍然无骨质影像,呈骨性低密度区,与周围正常骨组织间界限仍然很明显。3 HE染色观察术后2周淫羊藿苷组和CGF组颅骨缺损区中央被大量的纤维结缔组织充填,胶原纤维粗大,破骨细胞数量丰富。对照组可见缺损区大量纤维组织充填,炎性细胞分布广泛,三组均未有新生骨基质形成。术后4周淫羊藿苷组和CGF组颅骨缺损区纤维结缔组织有所减少,但胶原纤维粗大,中间散在分布少量炎性细胞,可见少量新生纤维样骨组织。对照组大量纤维组织充填,炎性细胞广泛分布于纤维组织之中,破骨细胞数量多,成骨不明显。术后 8 周淫羊藿苷组和CGF组缺损区内有大量新生骨质形成,骨小梁增厚且连续,部分较成熟骨成网状排列,其中骨质致密的骨形成板层状,可见成骨细胞规律的,平行排列于板层样骨的周边,缺损区内新骨形成已经非常明显并且已基本充填整个缺损区。对照组缺损区炎性细胞大量存在于纤维结缔组织中,有一定量的成骨细胞存在,但缺损区边界有骨样组织生成,骨小梁周围可见少量破骨细胞存在。术后12周淫羊藿苷组和CGF组骨缺损处板层骨较成熟,成骨细胞丰富,骨小梁粗大并排列规则,破骨细胞已经极为罕见,胶原纤维数量丰富。对照组可见较多新生的编织骨,一定数量的新生骨逐渐充填骨缺损但大部分仍为为纤维组织充填,这些纤维结缔组织包绕着孤立的骨岛结构,骨小梁连续但细小,排列疏松紊乱,总体上纤维结缔组织成分较淫羊藿苷组和CGF组多。4骨计量学观察术后2周,4周,8周淫羊藿苷组与CGF组的松质区骨量(Tb·Ar%),骨小梁宽度(Tb·Wiμm),成骨细胞个数(OB·N)均明显大于对照组;破骨细胞个数(OC·N)明显低于对照组;而淫羊藿苷组与CGF组的松质区骨量(Tb·Ar%),骨小梁宽度(Tb·Wiμm),成骨细胞个数(OB·N),破骨细胞个数(OC·N)之间无统计学差异。术后12周淫羊藿苷组与CGF组的松质区骨量(Tb·Ar%),骨小梁宽度(Tb·Wiμm),成骨细胞个数(OB·N)均大于对照组;破骨细胞个数(OC·N)三组之间无显著性差异;而淫羊藿苷组与CGF组的松质区骨量(Tb·Ar%),骨小梁宽度(Tb·Wiμm),成骨细胞个数(OB·N),破骨细胞个数(OC·N)之间无统计学差异。5免疫组织化学检测BMP-2和TGFβ1蛋白表达结果BMP-2的免疫组化染色结果:从第4W开始至第12W,淫羊藿苷组和CGF组逐渐有新生软骨基质形成,逐渐形成新生的软骨基质和原始骨细胞BMP-2呈阳性反应,肉芽组织间质BMP-2呈阳性反应,肉芽组织中阳性染色均匀。TGFβ1的免疫组化染色结果同BMP-2的免疫组化染色结果一致,从第4W开始至第12W,淫羊藿苷组和CGF组都有一定数量新生软骨基质和成骨细胞形成,成骨细胞分泌的骨基质逐渐使得骨小梁变宽,TGFβ1逐渐呈阳性反应,肉芽组织间质也逐渐呈阳性反应,肉芽组织中阳性染色均匀。第二部分淫羊藿苷及富自体浓缩生长因子促进兔颅骨缺损修复的基因表达谱差异分析1 m RNA纯度及完整性鉴定对照组,淫羊藿苷组和CGF组RNA的OD260/OD280比值均位于1.9~2.0之间,纯度及浓度符合实验要求。凝胶电泳结果显示,对照组,淫羊藿苷组和CGF组RNA经琼脂糖凝胶电泳后可见三个条带出现,且第一条带(28S)亮度约为第二条(18S)亮度的两倍,各组提取的RNA完整性良好。2通过PARTEK分析软件,组间对比差异分析,分别筛选出基因信号上调和下调2倍差异的全部基因。2.1淫羊藿苷组与对照组比较2周,筛选条件2倍差异以上,共出现23个基因表达发生变化。(10个基因上调,13个基因下调)4周,筛选条件2倍差异以上,共出现35个基因表达发生变化。(10个基因上调,25个基因下调)2.2 CGF组与对照组比较2周,筛选条件2倍差异以上,共出现25个基因表达发生变化(5个基因上调,20个基因下调)4周,筛选条件2倍差异以上,共出现40个基因表达发生变化。(17个基因上调,23个基因下调)2.3CGF组与淫羊藿苷组比较2周,筛选条件2倍差异以上,共出现20个基因表达发生变化。(6个基因上调,14个基因下调)4周,筛选条件2倍差异以上,出现个42基因表达发生变化。(5个基因上调,37个基因下调)3汇总出前5位上调与下调最显著差异基因,并进行组间比较。其中淫羊藿苷组与对照组比较在2周和4周都出现HGF基因高表达;CGF组与对照组比较在2周和4周都出现Runx2基因高表达;淫羊藿苷组与CGF组比较在2周时出现ZIC5基因高表达,但在4周时未见。4在Pathway分析中,差异基因共涉及了10条途径,包括:蛋白消化和吸收(Protein digestion and absorption),5-羟色胺能神经突触(Serotonergic synapse),ECM受体相互作用(ECM-receptor interaction),粘着(Focal adhesion),肿瘤蛋白多糖化(Proteoglycans in cancer),PI3K-Akt信号途径(PI3K-Akt signaling pathway),钙离子信号途径(Calcium signaling pathway),扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy),平滑肌收缩(Vascular smooth muscle contraction)和神经活性的配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)。第三部分淫羊藿苷及富自体浓缩生长因子促进兔颅骨缺损修复的主要信号传导通路的探讨1 Real-time PCR检测淫羊藿苷组与对照组HGF的m RNA表达淫羊藿苷组与对照组样本RNA反转录成c DNA,进行Real-time PCR扩增,可见溶解曲线成单峰曲线,证明引物设计正确。进行Real-time PCR分析。结果显示,淫羊藿苷组HGF的m RNA表达显著高于对照组。2 Western blot检测淫羊藿苷组与对照组HGF、p-Akt的蛋白的表达提取淫羊藿苷组与对照组缺损区新生组织总蛋白进行Western blot分析。结果显示,淫羊藿苷组的HGF蛋白表达显著高于对照组。淫羊藿苷组p-Akt的蛋白表达显著高于对照组。3 Real-time PCR检测CGF组与对照组Runx2基因mRNA表达CGF组与对照组样本RNA反转录成c DNA,进行Real-time PCR扩增,可见溶解曲线成单峰曲线,证明引物设计正确。进行Real-time PCR分析。结果显示,CGF组Runx2的m RNA表达显著高于对照组。4 Western blot检测CGF组与对照组Runx2的蛋白的表达提取CGF组与对照组缺损区新生组织总蛋白进行Western blot分析。结果显示,CGF组Runx2蛋白表达水平显著高于对照组,CGF组ERK的磷酸化水平显著高于对照组。结论:1自体CGF与淫羊藿苷均能够增加兔颅骨缺损区成骨骨量,提高愈合质量。2自体CGF与淫羊藿苷均能促进兔颅骨缺损愈合质量与速度。3 HGF因子与Runx2因子分别在淫羊藿苷组、CGF组2周、4周均有较显著上调表达。4淫羊藿苷与CGF对颅骨缺损修复基因表达的影响不完全相同,两者发挥作用的途径和机制不尽相同。5淫羊藿苷能促进肝细胞生长因子HGF m RNA与蛋白表达。6淫羊藿苷通过激活PI3K/Akt信号途径促进HGF表达,进一步促进骨愈合,说明其在淫羊藿苷促进骨愈合中发挥重要作用。7 CGF能促Runx2 m RNA与蛋白表达。8 CGF能激活ERK MAPK信号途径促进Runx2表达,说明其在CGF促进骨愈合中发挥重要作用。