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研究背景及目的器官移植在肿瘤、血液系统异常和器官功能衰竭等疾病治疗中发挥了重要的作用,但是急性排斥反应(Acute Rejection, AR)仍是引发器官功能损害的重要因素,严重影响了移植者的预后。急性排斥反应一般发生于移植术后的数天或数月,应用无创非侵入性诊断技术进行早期动态监测,对于延长移植器官寿命,治疗疾病具有重要意义。尽管医学多个学科对在体评价移植器官功能进行了多种探索,包括检测循环中的移植排斥相关分子,组织活检及常规影像学检查,但是迄今为止,移植器官的病理学组织活检诊断仍是诊断急性移植排斥反应的金标准。由于组织活检的创伤性和伴发的副作用严重制约了其在临床上的应用。目前临床上急需探索发现高选择性移植器官组织的靶向分子,无创性非侵入性在体评价移植器官急性移植排斥反应及功能状态。分子影像学(molecular imaging)是近年来形成的将分子生物学技术与影像学技术相结合,进行分子水平上的定性定量的研究的科学。它以生物大分子作为靶点,可以实现在分子水平上对人体内部的生理或病理过程中进行无创、实时的体外显示及功能成像,实现疾病的早期诊断及预后。核分子影像中的放射性核素标记物可以有效进行体内示踪,是分子影像学中发展最快最成熟的技术。目前临床比较常用放射性核素氟18标记葡萄糖类似物进行正电子核素显像评价移植肾功能.这项技术属于非特异性分子影像,受到多种因素干扰；其他放射性核素标记分子的移植物显像也尚在探索之中,因此探索高选择性靶分子进行放射性核素标记,用于评价移植器官的功能状态具有重要意义。近来研究表明,Toll样受体家族(Toll-like receptor, TLRs)可特异性识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMPs),在激活固有(非特异性)免疫和诱导调节适应性(特异性)免疫中发挥着重要的作用,是连接非特异性免疫和特异性免疫的重要纽带。TLRs家族内唯一具有免疫负调节作用的分子是TLR5,它可以选择性的高表达于调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)的表面。研究发现,细菌鞭毛蛋白(Flagellin,Flic, TLR5的特异性激活剂)可以增强Treg细胞对效应性T细胞的抑制作用。鉴于TLR5能够调控Treg细胞效应,而Treg细胞在同种异体皮肤移植中发挥重要的作用。Flic是TLR5的唯一外源性特异配体,可特异识别并结合TLR5,从而促进T细胞和体液免疫应答。本实验室前期研究发现,在小鼠急性移植排斥过程中,TLR5表达与移植排斥严重性呈正相关,进一步提示TLR5可能是同种异体皮肤急性移植排斥中的关键分子。本论文制备放射性碘125标记基因重组Flagellin(rFlic)及其片段rFlic△180-400,研究其在同种移植急性排斥中的生物学分布及靶向性,旨在为靶向TLR5非侵入性实时监测同种移植排斥提供实验依据。研究方法1.小鼠皮肤移植模型的建立：随机选取C57BL/6小鼠(雌性,6-8周)作为供体,BALB/c、鼠(雌性,6-8周)作为受体,构建小鼠同种异体皮肤移植模型；以BALB/c小鼠(雌性,6-8周)均作为供体和受体,构建同系皮肤移植模型。制备供体鼠全厚度移植皮片,置冷PBS中保存待用；受体小鼠腹腔注射0.6%的戊巴比妥钠溶液(50μg/g)进行麻醉,之后在其右侧背部制备移植床,然后移植制备好的皮片。移植术后第7天进行拆包,每日仔细观察并记录移植皮片生长状况。当移植物的坏死组织超过了90%时,即视为移植物完全排斥。2.诱导表达基因重组鞭毛蛋白及其片段(rFlic和rFlic△180-400):利用本实验室保存的含有鞭毛蛋白全长(rFlic)及片段(rFlic△180-400)的GST-FliC-B.pseudomallei基因的pGEX4T-2质粒大肠杆菌BL21,分别通过IPTG诱导表达基因重组鞭毛蛋白及其片段(rFlic和rFlic△180-400),然后再用SDS-PAGE鉴定鞭毛蛋白诱导表达的状况。最后再用抗GST标签蛋白的抗体,通过蛋白印迹(Western Blot)鉴定纯化鞭毛蛋白及其片段所具有的生物活性。3.125I-rFlic及rFlic△180-400的制备：常规制备Iodogen涂管；通过Iodogen法,利用放射性核素碘-125碘化标记rFlic及rFlic△180-400, PD-10 Desalting凝胶柱(美国GE Healthcare)分离纯化,收集洗脱液,留取蛋白峰。4.标记物的放化纯及稳定性的测定：检测含有蛋白峰样本的放射性,计算其放射化学纯度；体外放置不同时间检测标记物的稳定性。5.放射性配基结合实验：脱椎处死BALB/c、鼠,取脾分离脾细胞加入试管,然后在试管中分别加入不同浓度的放射性核素碘-125标记rFlic及rFlic△180-400,在一定条件下,进行放射性标记配基的受体结合实验。6.药代动力学实验：模型小鼠常规封闭甲状腺后,在移植术后第8天分别通过尾静脉注射125I-rFlic及125I-rFlic△180-400后,不同时间取血,测定放射性,进行药代动力学分析。7.体内生物学分布实验：模型小鼠常规封闭甲状腺后,在移植术后第8天分别通过尾静脉注射125I-rFlic及125I-rFlic△180-400,一定时间后,处死小鼠,取重要器官和移植皮片以及对侧部位正常皮片,称重、测量放射性。计算每克组织放射性占总放射性的百分比(%ID/g)。8.全身磷屏放射自显影显像：模型小鼠常规封闭甲状腺后,移植术后第8天分别向小鼠尾静脉注射125I-rFlic及125I-rFlic△180-400,于注射后的6、24、48、72h,分别麻醉小鼠,进行全身磷屏放射自显影显像。研究结果1.成功构建了小鼠同种／同系皮肤移植模型：皮肤移植后第7天移植部位拆包后,发现移植皮片柔软、湿润,触摸皮下无硬结及颗粒感、周边伤口愈合良好、无红肿及脓液渗出,表明移植模型构建成功。2.基因重组鞭毛蛋白及其片段(rFlic与rFlic△180-400)诱导表达后进行鉴定,结果证实：成功诱导表达了rFlic与rFlic△180-400,纯化的rFlic与rFlic△180-400具有良好地生物学活性。3.成功碘化标记了rFlic与rFlic△180-400:125I-rFlic标记率为(93.5士0.15)%,125I-rFlic△180-400的标记率为(94+0.25)%。二者皆保持了较高的稳定性,72h后两者的放射性化学纯度仍高于93%。4.放射性配基结合实验结果表明：I25I-rFlic与125I-rFlic△180-400均可与BALB/c小鼠脾细胞的TLR5受体特异性结合,但125I-rFlic△180-400对BALB/c小鼠脾细胞TLR5的亲和力更高(P<0.05)。5.药代动力学结果表明：125I-rFlic与125I-rFlic△180-400在模型小鼠内均具有较好的药物代谢动力学特性,符合二室分布模型。与125I-rFlic相比,125I-rFlic△180-400可更快到达到分布平衡,并更快排出体外。6.体内生物学分布结果显示：两种示踪剂注射组,除移植皮片外,其它组织器官的放射性分布趋势比较一致；主要聚集在肝、肾。24h时125I-rFlic注射组的T/NT(移植皮片／对侧对照皮片)为2.5+0.34；而125I-rFlic△180-400注射组的T/NT比值明显升高,为3.5±0.25；两者具有显著的差异(P<0.05)。同系对照组移植皮片处无明显放射性浓集,24h时T/NT比值为1.45±0.54。与同系移植组相比,同种移植组的移植皮片处的放射性明显升高。7.磷屏放射自显影显像显示：两种标记物注射后6、24、48h,同系对照组移植皮片及其他各部位均未见明显放射性浓集。而同种移植排斥组,注射后6h,与125I-rFlic组相比,125I-rFlic△180-400组移植皮片显像清晰。24h时两种标记物注射组皆可见到移植皮片的清晰图像。48h时,图像清晰度均下降。同种/同系移植模型阻断实验组的移植皮片处在48h内均未见明显放射性浓聚。研究结论成功制备125I-rFlic与125I-rFlic△180-400,二者在同种移植急性排斥皮片处高度浓聚,提示制备的两种标记物均可成功显示同种移植急性排斥,而后者比前者拥有更快的代谢率和更快的特异性浓聚。研究结果可为TLR5靶向的同种异体移植排斥实时监测提供新的实验依据。