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研究目的:适宜的运动对心梗心脏具有一定保护作用,但运动对心梗心脏产生保护作用的具体机制尚未完全阐明。壳多糖酶3样蛋白1(Chitinase-3-like protein 1,CHI3L1)是分布于肝脏、心脏、脑、肾脏、肌肉、脂肪等部位的分泌型糖蛋白,在炎症和组织重塑过程中发挥作用,具有细胞生长因子样作用,可激活PI3K-AKT/ERK信号通路,促进细胞有丝分裂及生长,抑制细胞凋亡。运动可以促进体内几丁质酶 3 样蛋白 1(Chitinase-3-likeprotein1,CHI3L1)的表达,但 CHI3L1在有氧运动抑制心梗大鼠心肌细胞凋亡和促进血管新生中的是否发挥作用,其具体分子机制如何,尚无文献报道。本文以CHI3L1是否对心梗心脏产生保护效应为切入点,研究CHI3L1在有氧运动抑制心梗大鼠心肌细胞凋亡、促进心肌血管新生中的作用及其机制。研究方法:动物实验:SD大鼠随机分为正常组(C)、正常运动组(CE),采用左冠状动脉前降支结扎法(LAD)制备SD大鼠MI模型后,随机分为假手术组(S)、心梗组(MI)、心梗有氧运动组(ME),每组8只;注射PAR-2阻断剂(FSLLRY-amide,150mg/kg)实验分为心梗7d后PAR2阻断剂组(7d+FS)、心梗7d后生理盐水组(7d+SA),心梗14d后PAR2阻断剂组(14d+FS)、心梗14d后生理盐水组(14d+SA),每组8只。手术1wk后,ME组先进行1wk适应性跑台运动,后进行3wk有氧运动。训练结束后次日检测血流动力学指标评价心功能,腹主动脉取血,低温环境迅速取材;H9C2 细胞实验:采用重组人 CHI3L1 蛋白(rhCHIL1,150ng/ml,24h),AMPK 激动剂(AICAR,50mM,24h),PAR2 受体阻断剂(Veliparib,10μM,1h)、PI3K 抑制剂(LY294002,10μg/ml,40min)、脂多糖(LPS,1Oμg/ml,4h)干预H9C2细胞,将H9C2细胞分为H9C2组,+rhCHI3L1组,+AICAR组,+rhCHI3L1+AICAR 组、+rhCHI3L1+Veliparib,+AICAR+Veliparib,+CHI3L1+AICAR+Veliparib、LPS 组、+rhCHI3L1+LPS 组、+AICAR+LPS 组、+rhCHI3L1+AICAR+LPS 组、+LY294002+LPS 组、+LY294002+rhCHI3L1+LPS 组,共 13 组,用于细胞水平的增殖凋亡机制研究。HUVEC细胞小管实验:培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),rhCHI3L1(120 ng/ml,24h)、AMPK 激动剂(AICAR,2mM,24h)、PAR2 受体阻断剂(Veliparib,10μM,1h)、PI3K 抑制剂(LY294002,10μg/ml,30min)干预 HUVEC 细胞。将 HUVEC 细胞分为 HUVEC 组、+rhCHI3L1 组、+AICAR 组、+rhCHI3L1+AICAR组、+LY294002 组、+LY294002+rhCHI3L1 组、+Veliparib+AICAR 组、+LY294002+AICAR、+LY294002+Veliparib+AICAR 共 9 组,用于研究血管新生的作用机制。测试指标:Masson染色观察心肌胶原容积百分数(CFV%);免疫荧光观察H9C2和心脏组织切片细胞增殖;Tunel检测H9C2和心脏组织细胞凋亡;CCK-8检测细胞活性;细胞划痕和小管形成检测HUVEC细胞迁移分化及小管形成能力;Westernblotting 测定 H9C2、HUVE 及心肌中 CHI3L1、PAR2,pPI3K/PI3K,pAKT/AKT,pERK/ERK,Cyclin D1,Bax/Bcl-2 和 eNOS 蛋白表达;ELISA 试剂盒检测大鼠血清CHI3L1含量。研究结果:(1)有氧运动显著升高正常大鼠血清CHI3L1水平和增加心脏局部CHI3L1蛋白表达;显著升高MI心肌CHI3L1及其受体PAR2蛋白表达。(2)有氧运动显著升高MI心肌pPI3K/PI3K、pAKT/AKT、pERK/ERK 比值和eNOS及Cyclin D1表达,降低TUNEL颗粒数量和Bax/Bcl-2比值,增加MI心肌组织 PCNA+/vWF+和 KI67+/cTnT+数量。表明,有氧运动显著激活PI3K-AKT/ERK-eNOS、PI3K-AKT/ERK-Cyclin D1 以及 PI3K-AKT/ERK-Bax/Bcl-2信号通路,抑制细胞凋亡、促进血管新生。(3)有氧运动显著降低MI心脏心肌胶原容积百分比(CVF%)和左心室LVEDP,显著升高左心室±dp/dtmax和LVSP。表明,有氧运动显著降低MI心肌纤维化,改善心脏功能。(4)CHI3L1受体PAR2阻断剂(FSLLRY-amide),在MI 7d时显著降低pPI3K/PI3K、pAKT/AKT 和 pERK/ERK 比值;在 MI 14d 显著抑制心肌PI3K-AKT/ERK信号通路,升高MI心肌胶原容积百分比和左心室LVEDP,显著降低左心室±dp/dt max和LVSP。表明,CHI3L1受体PAR2阻断剂连续注射14d后心肌胶原面积显著增加,心梗心脏心功能降低。(5)AICAR干预上调H9C2细胞中CHI3L1和PAR2蛋白表达。提示,运动显著上调H9C2细胞CHI3L1及其受体PAR2表达。(6)外源性rhCHI3L1或(和)AICAR干预显著升高H9C2心肌细胞KI67+/cTnT+和CCK8值。表明,外源性rhCHI3L1或(和)AMPK激动剂AICAR干预均显著提高H9C2细胞增殖。(7)外源性rhCHI3L或(和)AICAR干预均显著提高pPI3K/PI3K、pAKT/AKT和pERK/ERK 比值。表明,外源性rhCHI3L1或(和)AICAR干预均显著激活PI3K-AKT/ERK 信号通路。(8)CHI3L1 受体 PAR2 抑制剂(Veliparib)显著降低 H9C2 细胞 pPI3K/PI3K、pAKT/AKT和pERK/ERK 比值。表明,CHI3L1或(和)运动干预是通过PI3K-AKT/ERK/信号通路发挥作用。(9)CHI3L1受体PAR2抑制剂(Veliparib)显著增加TUNEL 阳性颗粒数目,显著降低rhCHI3L1或(和)AICAR干预后Bax/Bcl-2比值。表明,rhCHI3L1或(和)AICAR干预均显著抑制LPS诱导的H9C2细胞凋亡。(10)外源性rhCHI3L1或(和)AICAR干预显著改善LPS抑制H9C2细胞PI3K-AKT/ERK信号通路,发挥抑制心肌细胞凋亡的作用。(11)PI3K 抑制剂(LY294002)显著抑制 CHI3L1 对 PI3K-AKT/ERK 磷酸化作用,提高Bax/Bcl2比值;rhCHI3L1干预显著升高pPI3K/PI3K、pAKT/AKT和pERK/ERK和显著降低Bax/Bc12的比值。表明,CHI3L1通过激活PI3K-AKT/ERK通路抑制H9C2细胞凋亡。(12)AICAR干预HUVEC细胞显著上调CHI3L1及其PAR2受体表达,表明,运动显著上调HUVEC的CHI3L1及其受体PAR2的蛋白表达。(13)AICAR干预组显著升高HUVEC细胞PI3K、AKT和ERK的磷酸化水平和eNOS表达;LY294002和AICAR干预显著降低PI3K、AKT和ERK磷酸化水平及eNOS表达。表明,运动显著激活PI3K-AKT/ERK-eNOS信号通路,促进血管新生。(14)rhCHI3L1或(和)AICAR干预显著提高HUVEC细胞eNOS蛋白表达和迁移分化能力;rhCHI3L1或(和)AICAR干预12h显著促进HUVEC小管形成。表明,rhCHI3L1或(和)运动干预显著上调eNOS表达,促进HUVEC小管形成。(15)rhCHI3L1干预显著上调HUVEC细胞的PI3K、AKT、ERK磷酸化水平和eNOS表达,PI3K抑制剂LY294002显著降低PI3K、AKT、ERK磷酸化水平和eNOS表达,表明rhCHI3L1显著激活PI3K-AKT/ERK信号通路促进血管新生。研究结论:(1)有氧运动显著升高CHI3L1/PAR2表达水平,促进MI心肌细胞核分裂,抑制MI心肌细胞凋亡,降低MI心肌纤维化,改善MI心脏功能。(2)运动显著激活 CHI3L1/PAR2-PI3K-AKT/ERK-Bax/Bcl2 表达水平,抑制H9C2心肌细胞凋亡。(3)运动显著激活 HUVEC 细胞 CHI3L1/PAR2-PI3K-AKT/ERK-eNOS 表达水平,诱导HUVEC细胞小管形成。因此认为,CHI3L1在有氧运动改善MI大鼠心功能中发挥重要作用,其机制是通过CHI3L1/PAR2-PI3K-AKT/ERK信号通路,抑制了心肌Bax/Bcl2蛋白表达水平,降低MI心肌细胞凋亡;上调心肌eNOS表达水平,促进MI心肌血管新生,改善微循环障碍,降低MI心肌纤维化,改善心功能。