目的：骨髓间质干细胞 (BMSCs) 具有分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等多种分化潜能，其分化的方向与所处微环境密切相关。已经证实，在体内心肌微环境下，骨髓间质干细胞可以分化为心肌样细胞，但对于其分化机制以及何种心肌组织内何种细胞对骨髓间质干细胞的定向分化起决定作用尚无明确解释和描述。本课题拟利用体外培养的心肌细胞、内皮细胞，建立体外细胞微环境，研究骨髓间质干细胞与之共培养后和单独培养后，形态和结构蛋白表达方面的变化，借此分析心肌组织内各种细胞微环境在此过程中的作用，以及不同的骨髓间质干细胞共培养密度对定向分化的影响，为骨髓间质干细胞心肌内移植提供理论依据。 方法：采取 Ficoll 梯度离心分离方法，获得 SD 大鼠骨髓间质干细胞，用细胞膜荧光染色剂 PKH-26 标记后，分别以 1×10~5、4×10~5、8×10~5cells／well 的密度与同源SD大鼠胎心细胞(cardiomyocytes, CMC)、血管内皮细胞(vascular endothelial cells, EC) 在六孔板中共培养以及单独培养。动态观察骨髓间质干细胞形态学的改变，并于第1、第4周时，通过检测心肌特异性结构蛋白Actin，分析各实验组中骨髓间质干细胞定向分化情况。 结果：BMSCs 经 PKH—26 标记后可以在实验全过程中得以识别。分离获得的BMSCs 贴壁后形状类似于成纤维细胞，在此后传代过程中基本保持不变。与 CMC共培养后细胞形态逐渐发生变化。1 周时，在BMSCs 1×10~5cells／well共培养组中，BMSCs 体积增大，外观变长，呈纺锤形或长棒状，少数细胞 (10％) 形态与肌管结构相类似，这部分 BMSCs 肌动蛋白 (Actin) 检测呈阳性。而在 BMSCs 4×10~5cells／well和8×10~5cell／well 共培养组中，BMSCs 表现为分裂旺盛，细胞形态无明显变化，形态发生改变的细胞数量明显少于低密度组，这两组中 BMSCs Actin检测呈阴性。2周后，在1×10~5cell／well 共培养组中，更多的 BMSCs 形状发生了上述改变，相邻的 BMSCs 之间发生细胞融合，形态与肌管样结构更加相似，并 第二军医大学硕士学位田立 胸心外科专业 与相邻胎鼠心肌细胞初步形成闰盘样结构，而在4X10、ells八elf、SX 10’。elfs／well共培养组中，BMSCs基本铺满培养皿，细胞密度大，但是形态改变 不明显，细胞间互相接触，但未见细胞融合。3周时，B肥Cs 10sceds砌elf 共培养组中，BMSCS外观形状与胎鼠心肌细胞更加相似，距离胎鼠心肌细胞越近， 形态变化越明显。与心肌细胞存在闰盘样连接的BMSCS在前者节律性舒缩的牵拉 作用下，细胞体积出现改变。在4X10’cells／well、8X10’cells／well共培养组 中，BMSCS细胞密度大，细胞体内出现空泡，细胞核质比减小，呈老化状态，进行－传代后，因CMC再生能力较差，BMSCS与CMC＊例更加悬殊，BMSCS形态无明显变 化，仅表现为细胞分裂、增殖。4周时在 B棚Cs 10、ells八elf共培养组中 40 ％的PKH26标记的细胞肌动蛋白（Actin）抗体染色呈阳性，而且距离胎鼠心肌细 胞越近，Actin抗体染色阳性率越高。BMSCs 4X10’、SX10’cells／。elf共培养组 中，不足 1％的标记细胞 Actin检测呈阳性。在与 EC共培养以及 BMSCs单独培养 时，各组中BMSCs均未出现肌管样结构，而且Actin检测呈阴性。 结论：研究结果表明，在体外培养的心肌细胞微环境中，骨髓间质干细胞可以 分化为心肌样细胞。合适的细胞比例对骨髓间质干细胞的分化具有重要作用。由 骨髓间质干细胞分化而来的心肌样细胞能够与心肌细胞之间建立闰盘样连接。