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背景:2015年《CA:临床医师癌症杂志》公布的全球癌症的最新统计结果显示,在全球最主要的致死癌症中,肝癌在男性中居第二位,女性中居第六位。而中国肝癌的发病人数占全球肝癌患者人数的50%,且超过90%的肝癌是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。免疫编辑学说认为免疫系统可以识别和清除肿瘤,而肿瘤可以通过多种机制逃避免疫监视作用。肿瘤免疫逃逸也被认为是肿瘤的十大特征之一。研究显示,肿瘤细胞表面的糖基化修饰在肿瘤免疫逃逸过程中发挥重要作用。蛋白质的糖基化是糖类在糖基转移酶(glycosyltransferasc,GTs)的催化下以共价键的形式与肽链连接的过程。唾液酸化是糖基化修饰的一种,主要由唾液酰基转移酶催化唾液酸以α2-3,α2-6或α2-8糖苷键连接于糖蛋白和糖脂的末端。糖基化异常是肿瘤癌变的一个重要特性,它会影响肿瘤免疫,血管生成和肿瘤发生发展的多个过程。超唾液酸化是癌症中最常见的糖基化变化之一,其在促进肿瘤生长中的作用已经在1960年代末就已经被确认,在这种"微进化”过程中获得的不同糖基化模式赋予了肿瘤生长,肿瘤传播和免疫逃逸方面的优势。ST6Gal-Ⅰ是催化α2-6连接的唾液酸化,并且已有文献表明,ST6Gal-Ⅰ在多种肿瘤中高表达,特别是转移组织中呈高表达,如乳腺癌、卵巢癌和子宫癌等。目前,ST6Gal-Ⅰ介导细胞表面N-聚糖唾液酸化在肝癌免疫逃逸中的作用及分子机制尚不完全清楚。目的:1.检测外源性ST6Gal-Ⅰ在肝癌细胞与T细胞(Jurkat细胞)共孵育系统中的作用。2.考察ST6Gal-Ⅰ表达上调对肝癌细胞与T细胞(Jurkat细胞)共孵育后微环境内细胞因子的影响。3.检测上调ST6Gal-Ⅰ对共孵育系统内肝癌细胞中迁移和凋亡相关蛋白的表达变化以及Jurkat细胞中凋亡相关蛋白的变化,探讨ST6Gal-Ⅰ介导肝癌免疫逃逸的分子机制。4.探究ST6Gal-Ⅰ表达上调后鼠肝癌细胞在小鼠体内的生长情况,检测ST6Gal-Ⅰ表达上调的肿瘤组织内T细胞浸润及活性情况,初步探究ST6Gal-Ⅰ在体内如何影响肝癌免疫逃逸。方法:1.用qPCR、Western blot和Lectin blot方法检测单克隆细胞株内ST6Gal-Ⅰ的mRNA、蛋白表达以及糖链表达水平;2.CCK-8试剂盒及Transwell小室的方法检测细胞的增殖及迁移,并用Annexin V-FITC/PI双染色法及TUNEL法检测细胞共孵育系统中Jurkat细胞与肝癌细胞株的凋亡;3.ELISA检测细胞共孵育系统中相关细胞因子的分泌情况,Agarose SNA免疫共沉淀及Western bolt方法分析ST6Gal-Ⅰ上调后HepG2细胞内Fas蛋白、CD147蛋白及Integrin-α3蛋白的唾液酸化水平;4.Western bolt方法分析ST6Gal-Ⅰ上调对共孵育系统中HepG2细胞内CD147/MMPs信号通路及Fas-FasL信号通路和Bcl-2家族的影响,以及对Jurkat细胞内PI3K/Akt/NF-κB信号通路及线粒体凋亡途径通路和Bcl-2家族的影响;5.分别将过表达ST6Gal-Ⅰ的鼠肝癌细胞Hepal-6和Hca-P接种至C57BL/6J小鼠腹股沟皮下,并用游标卡尺记录肿瘤生长情况,用免疫组化方法检测T细胞的浸润情况以及用qPCR和ELISA方法检测瘤内及血清中IFN-γ和TNF-α的分泌情况;6.用流式细胞仪分选高纯度的C57BL/6J小鼠脾脏、肿瘤组织和人外周血T细胞,与上调ST6Gal-Ⅰ的肝癌细胞进行共孵育,CCK8法检测CD8+T细胞的增殖情况,ELISA方法检测CD4+T细胞分泌IL-2的情况。结果:1.筛选得到的单克隆细胞(HepG2/ST)中ST6Gal-Ⅰ的mRNA、蛋白及糖链表达显著增加2.ST6Gal-Ⅰ表达上调增加了 HepG2细胞的增殖及迁移能力,同时减弱了共孵育系统中Jurkat细胞的增殖能力,增加了 Jurkat细胞的凋亡且抑制了 HepG2细胞的凋亡;3.ST6Gal-Ⅰ表达上调增加了共孵育微环境中免疫抑制因子如TGF-β、IL-10的含量,降低了细胞因子如IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-2等的含量,且过表达ST6Gal-Ⅰ使CD147及Fas蛋白表面α2,6连接的唾液酸增多,与Jurkat细胞共孵育后,上述变化明显;4.与对照组相比,过表达ST6Gal-Ⅰ组CD147、MMP2/7/9、抗凋亡蛋白Bcl-2及FasL的表达明显增加,而促凋亡蛋白Bax和Bad表达明显减弱,与Jurkat细胞共孵育后这种趋势更为明显;而在Jurkat细胞中,与对照组相比,ST6Gal-Ⅰ 上调使 Jurkat 细胞内 Fas、p-GSK-3β、Bax、Bad、cytochrome c、caspase9 和 caspase3 表达明显增加,而 PI3K、p-Akt、NF-κB(p65)和 Bcl-2 表达明显降低,但FasL、Akt和GSK-3β的表达无明显差异;5.与对照组相比,过表达ST6Gal-Ⅰ的肝癌细胞在小鼠体内的肿瘤体积更大,同时过表达ST6Gal-Ⅰ的瘤体组织内CD8+T细胞的浸润以及瘤内IFN-γ和TNF-α的分泌均明显减少;6.与对照组相比肝癌细胞上调ST6Gal-Ⅰ的表达可减弱CD8+T细胞增殖能力并抑制CD4+T细胞分泌IL-2。结论:1.过表达ST6Gal-Ⅰ可增强HepG2细胞的增殖及迁移能力,抑制免疫细胞引起的凋亡。2.肝癌细胞中上调ST6Gal-Ⅰ的表达可降低Jurkat细胞在肿瘤细胞与T细胞(Jurkat细胞)共孵育系统中的细胞活力,并促进其凋亡。3.肝癌细胞中高表达ST6Gal-Ⅰ可干扰免疫细胞因子的分泌,影响肿瘤微环境。4.过表达ST6Gal-Ⅰ可通过上调CD147/MMPs信号通路并抑制Fas介导的凋亡,促使肝癌细胞HepG2免疫逃逸。5.肝癌细胞中上调ST6Gal-Ⅰ的表达可通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路,抑制Jurkat细胞的活性,从而进一步抑制其免疫监视作用。6.肝癌细胞中过表达ST6Gal-Ⅰ,可促进其在小鼠体内成瘤生长,减少肿瘤组织内CD8+T细胞的浸润以及体内TNF-α、IFN-γ及IL-2的分泌,进而减弱CD8+T细胞的抗肿瘤免疫作用,促使肿瘤免疫逃逸。