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肝素酶Ⅲ(HepⅢ)是一种特异性裂解硫酸乙酰肝素分子中糖苷键的酶。先前的文献报道重组肝素酶Ⅲ在大肠杆菌中表达时极易形成包涵体，而且包涵体很难通过复性得到有活性的蛋白。本研究以肝素黄杆菌基因组DNA为模版，PCR扩增HepⅢ基因，分别在其N末端融合His6-Tag和GST-Tag，并将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中进行表达。15℃低温诱导，大约90％的融合蛋白均以可溶性形式表达。
His6-HepⅢ粗酶液经过镍柱纯化之后，纯化倍数为338.66，比活高达116.16 IU/mg，酶活回收率为33.3％。GST-HepⅢ粗酶液经过GST柱纯化之后，纯化倍数为199.4，比活高达107.7 IU/mg，酶活回收率为32.3％。
通过一系列单因素实验对E.coli BL21(DE3)生产GST-HepⅢ融合蛋白的培养条件进行了优化，得到最佳诱导时机是在菌体对数生长中后期，最佳IPTG浓度为0.5 mmol/L，最佳诱导时间为12 h，最佳钙离子浓度为0.3 mmol/L。
将纯化后所得的HepⅢ进行酶学性质研究，实验结果表明His6-HepⅢ的最适温度为50℃，最适pH7.5，最适NaCl浓度100 mmol/L。GST-HepⅢ的最适温度30℃，最适pH7.5，最适NaCl浓度150 mmol/L。His6-HepIII和GST-HepⅢ均对温度比较敏感，当温度高于40℃时，His6-HepⅢ和GST-HepⅢ的酶活均损失50％以上。在pH7.0～10.0范围内，两者均较稳定。 Ca2+对His6-HepⅢ和GST-HepⅢ都有不同程度的激活作用。His6-HepⅢ裂解产物的GPC-HPLC结果显示，His6-HepⅢ的裂解产物与天然HepⅢ裂解产物相同。同时我们发现His6-HepⅢ不仅能裂解乙酰肝素，还能裂解肝素。这一发现对低分子量肝素的制备以及肝素和乙酰肝素的结构分析具有重要意义。
用同样的方法我们构建了pGEX-HepI重组质粒，并在E.coli BL21(DE3)中表达GST-HepⅠ融合蛋白。GST-HepⅠ粗酶液经过GST柱纯化之后，比活为124.7 IU/mg，酶活回收率为31.0％。将纯化后所得GST-HepⅠ进行酶学性质研究，结果表明GST-HepⅠ的最适温度为30℃，最适pH7.0，最适NaCl浓度200 mmol/L。GST-HepI对温度很敏感，当温度高于30℃时酶活损失严重。在pH7.0～11.0范围内酶较稳定。Ca2+对酶有很强的激活和保护作用，在培养基中添加适量Ca2+能提高酶的产量。GPC-HPLC结果显示GST-HepⅠ与天然HepⅠ的降解产物完全相同。