研究背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease,AD)是最常见的中枢神经系统变性病,是老年期痴呆的主要原因。AD脑特征性的病理变化是:神经细胞外β-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)异常沉积形成的老年斑和细胞内过度磷酸化的Tau蛋白形成的神经原纤维缠结以及突触的失能和神经元的丢失。已经证明A β的异常沉积导致突触失能,并通过诱导细胞凋亡导致神经退行性变。目前AD仍无有效的干预措施,已有的药物仅能延缓病情的进展,其根本原因在于发病机制尚不明确,无针对性治疗靶点,这是目前亟待解决的根本问题。对梅奥医学中心AD患者临床注册研究的调查显示,80%的AD患者有葡萄糖耐受不良或糖尿病。从最初的鹿特丹研究开始,临床和流行病学积累了越来越多的证据,证明糖尿病患者有很大的可能罹患认知障碍,对痴呆,尤其是AD的易感性增加。Ott和他的同事们也证实,同正常对照相比,糖尿病患者罹患痴呆的风险增加2倍。目前认为,即便是长时间的糖尿病前期状态,也可能显著增加罹患痴呆的风险。AD和2型糖尿病有很多共同的病理特征:包括异常的蛋白加工过程、胰岛素信号通路异常、葡萄糖代谢失调、氧化应激、晚期糖基化终末产物的形成以及炎症通路的激活等。AD脑显示胰岛素缺陷、胰岛素信号通路的改变和/或异常激活,重要的是,对胰岛素的反应能力降低。胰岛素缺陷和胰岛素抵抗以及对胰岛素和胰岛素样生长因子的大量干扰代表了 AD早期和进展期的异常病理过程,可以从分子、生化及组织病理等多个角度解释AD的绝大多数病变,因此,AD又被认为是一种选择性的脑型糖尿病,即“3型糖尿病”。胰岛素抵抗在AD中的关键作用是与Aβ的形成和沉积、神经元纤维缠结的形成、突触传导的失调和神经元变性有关。因此,如何有效的抑制胰岛素抵抗可能是AD治疗的一个新靶点。神经炎症是AD另一个早期和持续的病理特征,而过氧化应激被证实为诱发因素。c-Jun氨基末端激酶(c-JunNH2-terminal kinase,JNK)信号通路与过氧化应激和胰岛素抵抗有关。JNK被过氧化氢激活,从而激活γ-分泌酶,而后者Aβ的形成中有着非常重要的作用。研究证实,Aβ不仅沉积在中枢神经系统,还可沉积在皮肤、皮下组织和肠道等神经以外的组织结构中。近年来,多数学者致力于AD脑神经炎症和胰岛素抵抗的相关机制研究,对AD肠道炎症机制和胰岛素抵抗的相关研究却甚少涉及。肠道和大脑之间存在着一个复杂的交互系统,通过神经、内分泌、免疫之间的相互作用交互联系,称为“肠脑轴”(Gut Brain Axis,GBA)。GBA不仅保证恰当的肠道自稳态,而且对情感、动机及高级认知功能都有重要的影响。肠道神经系统是肠脑轴的重要组成部分,可以独立于中枢神经系统而起作用,因此,肠道又被称为身体的“第二大脑”。肠道巨噬细胞是体内最大的常驻巨噬细胞群体,分布在肠道全程,肠道的巨噬细胞同肠道神经系统之间建立了密切链接,两者之间通过β 2肾上腺素受体(β 2-adrenergic receptor,β2-AR)及其配体交互作用。由此我们推测,肠道巨噬细胞功能状态对肠道神经系统、对GBA的功能有重要影响。近年来越来越多的临床和实验室证据表明肠道微生物群对机体功能的重要影响,而肠道微生物群的变化可以影响肠道巨噬细胞的功能,激活炎症信号通路,导致胰岛素信号通路受损。我们的研究主要围绕A β对肠道巨噬细胞的功能影响以及可能的作用机制展开。研究目的:1.明确在AD转基因鼠肠道中是否存在胰岛素抵抗以及Aβ对胰岛素抵抗的作用;2.明确Aβ对肠道巨噬细胞功能的影响及其可能机制。研究方法:1.动物和细胞动物模型:APP/PS1(β淀粉样前体蛋白/早老蛋白)转基因小鼠是目前AD研究领域应用较广泛的动物模型,通过上海茂生生物科技发展有限公司购自美国杰克逊实验室;WT小鼠,购于广东省医学实验动物中心,各20只。动物房饲养,分别分笼喂养(4-5只/笼),自由摄食和饮水。我们选取12月龄的健康小鼠进行相关实验。细胞培养:小鼠肠道巨噬细胞(RAW264.7)细胞购自上海生物研究所。细胞放在37℃、含5%CO2的细胞培养箱中培养,注意湿度饱和;培养基采用DMEM培养基,内加10%胎牛血清;培养基中添加双抗:100mg/ml链霉素和100U/ml的青霉素。定期观察细胞的生长情况,待细胞进入对数生长且状态良好时进行细胞的冻存、传代和药物处理。2.免疫组化实验小鼠麻醉后处死,打开腹腔,取距幽门20cm处回肠组织,清除残留粪便,用4℃生理盐水冲洗后,置于4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,用于免疫组化染色。免疫组织化学染色抗体使用浓度(IR 1:1000、IRS1 1:1000、Aβ 1:200、Tuj 1:500、KIBRA 1:200、β2AR 1:400、eNOS 1:400)。DAB体系室温显色。应用Image J图像处理软件进行相关图像分析。3.Aβ25-35寡聚体的制备:用0.33ml双蒸水中将A β 25-35肽段1mg溶解,将浓度调整为1 nmol/uL,封口膜封好,置于37℃水浴箱中连续孵育96h,充分聚集、“老化”后备用。4.MTT 法(MTT assay)取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。用不同浓度的Aβ 25-35处理细胞,然后低浓度组A β25-35再加用胰岛素处理,对照组不做处理,细胞的活力用MTT法进行检测,并计算相对增长率。细胞相对增值率=(实验组吸光度值-对照组吸光度值)/对照组吸光度值X1000%。5.酶联免疫吸附测定法(ELISA assay)取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。用不同浓度的Aβ25-35处理细胞,然后低浓度组Aβ25-35再加用胰岛素处理,对照组不做处理,结束后取细胞上清,用ELISA法检测IL-6和TNF-α水平。6.免疫蛋白印迹(Western Blot)取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞铺于6孔板中培养24h,用不同浓度的Aβ25-35处理细胞,然后低浓度组Aβ 25-35再加用胰岛素处理,对照组不做处理。药物处理结束后分别用RIPA缓冲液提取细胞蛋白,变性处理、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显影。检测不同干预条件下RAW264.7巨噬细胞细胞胰岛素信号通路相关蛋白的表达:IR-β、IRS1、p-IRS1 Ser307、AKT、p-AKT Ser473、JNK、p-JNK Tyr185。一抗抗体浓度:β-actin 1:1000;IR-β 1:800;IRS1 1:1200;p-IRS1 Ser307 1:1200;P-Akt Ser473 1:900;Akt 1:900;JNK 1:1100;p-JNK Tyr185 1:1100。蛋白表达水平用内参蛋白β-actin标准化。应用QUANTITY ONE凝胶电泳图像分析仪分析结果。7.数据分析(Statistic Analysis)应用SPSS version 19.0(IBM,Armonk,NY,USA)统计学软件进行统计学分析,多组数据间比较采用的是one-way ANOVA检测方法,多组间两两比较采用LSD方法。所有分析数据结果均以均数±标准差(Mean ± SD)表示,以p<0.05为差异,具有统计学意义。研究结果:1.免疫组化对比AD小鼠和WT小鼠肠道总的IR、IRS1、Aβ、Tuj、KIBRA、β2AR、eNOS的区别免疫组化结果显示:AD小鼠回肠中IRS1、Aβ、Tuj、KIBRA、β2AR、eNOS的蛋白表达量较WT小鼠明显增加,有统计学差异(P<0.05);而IR的量在两组小鼠中无明显差异。2.Aβ25-35对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响MTT实验结果显示,Aβ25-35促进了 RAW264.7细胞的增殖,与空白组对照有统计学差异(P<0.01),且与A β 25-35剂量呈正相关。而胰岛素处理后细胞增值率较A β 25-35组明显降低(P<0.05)。3.Aβ25-35对巨噬细胞炎症因子分泌的影响巨噬细胞经Aβ25-35处理后,炎症因子TNF-α和IL-6分泌明显增多,并与Aβ25-35剂量成正相关,随着Aβ25-53剂量的增大,分泌量逐渐增加,与空白组对比有统计学差异(P<0.01)。而经胰岛素处理后,较单纯使用Aβ25-35明显降低,且有统计学意义(P<0.05)。4.Aβ25-35 对 RAW264.7 巨噬细胞中 IR-β、IRS1、p-IRS1、AKT、p-AKT、JNK、p-JNK 的影响Aβ25-35能明显降低巨噬细胞IR-β蛋白含量(P<0.01),而胰岛素处理后又能明显提高IR-β的量(P<0.05);此外,Aβ25-35又明显降低巨噬细胞p-AKT/AKT的比值(P<0.01),而胰岛素处理后又能明显提高该比值(P<0.05);Aβ25-35能明显增加巨噬细胞中p-IRS1/IRS1和p-JNK/JNK的比值(P<0.01),而胰岛素处理后使这两种比值又趋向于空白水平(P<0.01)。结论:1.APP/PS1小鼠肠道Aβ异常沉积,IRS1表达增多,IR无差别,提示AD小鼠肠道内存在胰岛素抵抗,而Aβ对此有诱导作用。2.APP/PS1小鼠肠道β2AR、KIBRA、Tuj表达增多,肠道神经交感活性增高,巨噬细胞功能活化。3.A β25-35可诱导巨噬细胞增殖,活性明显增强。4.A β 25-35诱导下,巨噬细胞的胰岛素信号通路受损,其机制与JNK通路有关。