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对虾肝胰腺细小病毒(Hepatopancreaticparvovirus，HPV)是世界各地养殖和野生对虾的重要病原之一，隶属于细小病毒科(Parvovirus)，细小病毒亚科(Parvoviridae)。它分布广泛，虽然对对虾的致死率不是很高，但能使中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)、.斑节对虾(Penaeusmonodon)等10多种对虾生长畸形，导致慢性矮小残缺综合症(runt-deformitysyndrome，RDS)，造成较大的经济损失。目前，GenBank已经收录了分离自泰国、印度、澳大利亚、韩国、马达加斯加等地的HPV全长或部分基因组序列。虽然中国大陆局部地区在养殖对虾中检测到了HPV，但未见其基因组序列的报道。且目前国内外均没有相关HPV功能基因的相关研究。本文首次克隆了中国地区对虾HPV全基因组序列，并对其结构蛋白进行了表达、自组装病毒样颗粒(VLPS)机制的研究，进而可以利用RNAi、抗体阻断、竞争抑制物、小分子药效团的开发等基因工程、转录工程、蛋白质工程以及新近的代谢工程技术来实现防治WSSV的感染。
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中国对虾肝胰腺细小病毒HPV-Pc(河北分离株)全基因组序列的克隆及序列分析本论文首先利用RACE技术，根据已知的一段序列设计两对正向、反向引物，通过DNA末端加尾和嵌套PCR克隆了HPV基因3’片段和5’片段序列，然后将3部分片段拼接后得到中国河北株HPV基因组序列。不同地区、不同对虾HPV基因组有较大差异，河北株HPV基因组长6085nt，与其它已知序列同源性在78％～91％之间，差异遍布整个序列中。HPV基因组由两末端非编码序列和三个开放阅读框(openreadingframe，ORF)构成。三个ORF分别包括1384nt、1737nt和2466nt，预测分别编码非结构蛋白2(nonstructuralprotein2，NS2)、非结构蛋白1(nonstructuralprotein1，NS1)和衣壳蛋白(capsidprotein，CP)，分子量分别为50kDa，66kDa和92kDa。2衣壳蛋白CP的原核重组质粒pET30a-CP的构建及其在E.coli中表达分析本实验基于河北株HPV的CP基因设计了一对引物，并引入BamHI和XhoI酶切位点，PCR扩增出cp的基因片段，将全长衣壳蛋白基因分别定向克隆到原核表达载体pET30a(+)，转化进入大肠杆菌EscherichiacoliBL21中，经双酶切、菌落PCR、测序鉴定，表明成功构建了原核重组表达载体pET30a(+)-CP。阳性单克隆经IPTG浓度梯度、温度梯度诱导优化表达条件，成功表达了氨基末端融合有6个组氨酸标签的衣壳蛋白，SDS-PAGE和WesternBlot分析在菌体裂解沉淀中可见97kDa左右的特异性条带，而不同温度诱导上清中均没有特异性条带出现，表明原核表达HPV重组衣壳蛋白(recombinantHPVcapsidprotein，rCP)以包涵体的形式表达，所以在变形条件下用金属螯合亲和层析柱对rCP进行纯化、透析复性去除变性剂。电镜观察复性蛋白结果rCP可形成直径约为22nm的完整或不完整病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)，其外观与已报道过的天然HPV病毒颗粒相似；通过SDS-PAGE后切胶大量制备重组蛋白rCP，经Western-blot鉴定后作为抗原直接免疫小白鼠来制备抗CP的多克隆抗体。制备的抗血清经Western-blot和ELISA法检测抗体的特异性和效价。结果表明抗CP多克隆抗体能特异性识别rCP，效价测定结果为1∶600。多抗的制备对于后续的CP活性蛋白的测定以及病毒样颗粒的定性研究都有很重要的价值。
3rCP的真核重组质粒pEGFP-CP的构建及转染人胚肾293T细胞、大菱鲆鳍条细胞的研究衣壳蛋白CP基因分别引入BamHI和Xhol酶切位点，将PCR扩增的目的片段定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1，经酶切、菌落PCR鉴定后测序，表明成功构建了真核表达质粒EGFP-N1-CP。提取浓度大于2.5mg/ml的重组质粒后，分别转染人胚肾293T细胞和大鲮鲆鳍条细胞，荧光显微镜能够检测到荧光产生，电镜结果显示，可溶性的rCP可形成数量不多的直径约为22nm的病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)，说明rCP以可溶的形式得到表达。可以看出，HPVVLPs的形成不需要HPV的其他蛋白及其DNA或RNA的参与，并且融合表达的His和GFP标签展示于VLPs的表面且不影响VLPs的形成g鉴于HPV与对虾白斑综合症病毒(Whitespotsyndromevirus，WSSV)能同时感染多种对虾，期望能将HPVVLPS改造成能和WSSV感染相关蛋白基因VP28和VP37等融合表达的载体，发挥干扰WSSV感染的作用，为WSSV的防治提供有力手段。