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目的:
研究长链非编码RNA(LncRNA)H9、S-腺苷高半胱氮酸水解酶(SAHH)以及DNA甲4转移酶1(DNMT1)在苯并[a]芘(BaP)所致BEAS-2B细胞8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(OGG1)甲基化、DNA氧化损伤及细胞周期阻滞的影响。
方法:
通过siRNA技术构建六种低表达Csi-H79,si-SAHH,si-DNMT1,si-H19+si-SAHH,si-H19+si-DNMT1,si-SAHH+si-DNMT1)细胞模型,均设有阴性序列对照组。通过采用Westernblot检测DNMTs蛋A表达水平,通过采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测DNMT1活性及8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含罱,通过采用免疫共沉淀(Co-IP)检测SAHH和DNMT1的相互作用,通过免疫荧光(IF)观察H19、SAHH及DNMT1的分布,通过采用焦磷酸测序法检测0GG1基因甲基化水平,通过采用流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布。
结果:
染毒后,BEAS-2B细胞中DNMT1的表达量升高(P<O.O5),在32μmol/LBaP染毒24h时较溶剂对照升咼/58%.DNMT3B的表达量降低(P<0.05),在32μmol/LBaP染毒24h时较溶剂对照降低了39.4%,而DNMT3A表达量变化在32μmol/LBaP染毒24h时不显著(P>0.05)。
染毒后各型低表达(si-H19,skSAHH,si-H19,+skSAHH)细胞DNMT1表达和活性水平,与WT染毒细胞相比,明显降低(P<O.O5))。转染与染毐有交互效应(P<O.O5)。调整染毒因素为协变量,si-H19+SAHH细胞DNMT1表达和活性水平的修正均数(表达0.68,活性0.62)较WT细胞的修正均数(表达1.18,活性1.18)明显降低(P<0.05)。
Co-IP结果发现,染毐后WT细胞和si-NC细胞DNMT1结合SAHH蛋白含量与WT末染毒细胞相比,显著升高了42.6%和40.5%(P<0.05)。在si-H19细胞染毒后,与正常未染毒细胞相比,DNMT1结合SAHH蛋白含量显著升高了56%(P<0,05〉。转染与染毒有交互效应(P<0.05).,调整染毒因素为协变量,si-H29细胞DNMT1结合SAHH蚩白含量的修正均数(1.38)较WT细胞的修IE均数(1.21)明显升高(P<0.05)。
IF结果发现,BaP染毒后,BEAS-2B细胞中H19、SAHH和DNMT1主要在核周质以及细胞核中存在共定位。染毒后细胞内DNMT1蛋白表达的荧光与WT细胞相比加强,H19和DNMT1以及SAHH和DNMT1在核周质以及细胞核中共定位的荧光强度増强。在si-H19细胞染毒后,与si-H19细胞未染毒相比,SAHH和DNMT1在核周质以及细胞核中共定位的荧光强度增强。
焦磷酸测序结果发现,染毒后各型(WT、si-NC、si-DNMT1,si-H19+si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1细胞OGG1甲基化水平,与WT未染毒细胞相比,均显著升高(P<0.05),其屮si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1细胞染毒前后甲基化水平,与WT未染毒细胞相比,均明显升高(P<0.05)。与WT染毒细胞相比,si-SAHH+si-DNMT1细细胞染毒后OGG1甲基化水平升高了21.1%(P<0.05)。转染与染毒有交互效应(P<0.05)。调整染毒因素为协变量,与WT细胞OGG1甲基化水平的修正均数(1.14)相比,si-DWMT1细胞(1.28)和si-?SAHH+si-DNMT1细胞(1.37〉明显升高(P<0.05)。
ELISA结果发现,染毒后各型(WT、si-NC、si-DNMT1,^si-H19+si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1)细胞8-OHdG含量,与WT未染毒细胞相比,均显著升高(P<0.05),且与WT细胞染毒后相比,si-SAHH+si-ZNMT1细胞染毒后8-OHdG含量升高了19.2%(P<0.05),si-H19+si-DNMT1细胞则未见明显差异(P>0.05)。转染与染毒有交互效应(P<0.05)。调整染毒因素为协变量,与WT细胞8-OHdG含量的修正均数(1.15)相比,si-DNMT1细胞(1.20〉和si-SAHH+si-DNMT1细胞(1.24)明显升高(P<0.05)。
FCM结果发现,染毒后各型(WT、si-NC、si-DNMT1,si-H19+si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1)细胞S期细胞比率,与WT未染毒细胞相比,均分别升高了33.6%、34.0%、34.6%、38.0%和60.2%(P<0.05),其中无论是否染毒,si-H19+si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1细胞S期细胞比率,与WT未染毒细胞相比,均明显升高(P<0.05);与WT细胞染毒后相比,染毒后si-SAHH+si-DNMT1细胞明显升高了22.6%(P<0.05),而si-H19+si-DNMT1细胞则未见明显差异(P>0.05)。转染与染毒有交互效应(P<0.05)。调整染毒因素为协变量,与WT细胞S期细胞比率的修正均数(1.24)相比,si-SAHH+si-DNMT1细胞(1.37)明显升高(P<0.05)。
结论:
1、BaP染毒后H19与SAHH的结合调控DNMT1,使其表达和活性升高。
2、BaP染毒促进SAHH和DNMT1结合,干扰H19进一步增强两者的相互作用。
3、H19/SAHH/DNMT1参与调控OGG1甲基化、DNA氧化损伤和细胞周期。
研究长链非编码RNA(LncRNA)H9、S-腺苷高半胱氮酸水解酶(SAHH)以及DNA甲4转移酶1(DNMT1)在苯并[a]芘(BaP)所致BEAS-2B细胞8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(OGG1)甲基化、DNA氧化损伤及细胞周期阻滞的影响。
方法:
通过siRNA技术构建六种低表达Csi-H79,si-SAHH,si-DNMT1,si-H19+si-SAHH,si-H19+si-DNMT1,si-SAHH+si-DNMT1)细胞模型,均设有阴性序列对照组。通过采用Westernblot检测DNMTs蛋A表达水平,通过采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测DNMT1活性及8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含罱,通过采用免疫共沉淀(Co-IP)检测SAHH和DNMT1的相互作用,通过免疫荧光(IF)观察H19、SAHH及DNMT1的分布,通过采用焦磷酸测序法检测0GG1基因甲基化水平,通过采用流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布。
结果:
染毒后,BEAS-2B细胞中DNMT1的表达量升高(P<O.O5),在32μmol/LBaP染毒24h时较溶剂对照升咼/58%.DNMT3B的表达量降低(P<0.05),在32μmol/LBaP染毒24h时较溶剂对照降低了39.4%,而DNMT3A表达量变化在32μmol/LBaP染毒24h时不显著(P>0.05)。
染毒后各型低表达(si-H19,skSAHH,si-H19,+skSAHH)细胞DNMT1表达和活性水平,与WT染毒细胞相比,明显降低(P<O.O5))。转染与染毐有交互效应(P<O.O5)。调整染毒因素为协变量,si-H19+SAHH细胞DNMT1表达和活性水平的修正均数(表达0.68,活性0.62)较WT细胞的修正均数(表达1.18,活性1.18)明显降低(P<0.05)。
Co-IP结果发现,染毐后WT细胞和si-NC细胞DNMT1结合SAHH蛋白含量与WT末染毒细胞相比,显著升高了42.6%和40.5%(P<0.05)。在si-H19细胞染毒后,与正常未染毒细胞相比,DNMT1结合SAHH蛋白含量显著升高了56%(P<0,05〉。转染与染毒有交互效应(P<0.05).,调整染毒因素为协变量,si-H29细胞DNMT1结合SAHH蚩白含量的修正均数(1.38)较WT细胞的修IE均数(1.21)明显升高(P<0.05)。
IF结果发现,BaP染毒后,BEAS-2B细胞中H19、SAHH和DNMT1主要在核周质以及细胞核中存在共定位。染毒后细胞内DNMT1蛋白表达的荧光与WT细胞相比加强,H19和DNMT1以及SAHH和DNMT1在核周质以及细胞核中共定位的荧光强度増强。在si-H19细胞染毒后,与si-H19细胞未染毒相比,SAHH和DNMT1在核周质以及细胞核中共定位的荧光强度增强。
焦磷酸测序结果发现,染毒后各型(WT、si-NC、si-DNMT1,si-H19+si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1细胞OGG1甲基化水平,与WT未染毒细胞相比,均显著升高(P<0.05),其屮si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1细胞染毒前后甲基化水平,与WT未染毒细胞相比,均明显升高(P<0.05)。与WT染毒细胞相比,si-SAHH+si-DNMT1细细胞染毒后OGG1甲基化水平升高了21.1%(P<0.05)。转染与染毒有交互效应(P<0.05)。调整染毒因素为协变量,与WT细胞OGG1甲基化水平的修正均数(1.14)相比,si-DWMT1细胞(1.28)和si-?SAHH+si-DNMT1细胞(1.37〉明显升高(P<0.05)。
ELISA结果发现,染毒后各型(WT、si-NC、si-DNMT1,^si-H19+si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1)细胞8-OHdG含量,与WT未染毒细胞相比,均显著升高(P<0.05),且与WT细胞染毒后相比,si-SAHH+si-ZNMT1细胞染毒后8-OHdG含量升高了19.2%(P<0.05),si-H19+si-DNMT1细胞则未见明显差异(P>0.05)。转染与染毒有交互效应(P<0.05)。调整染毒因素为协变量,与WT细胞8-OHdG含量的修正均数(1.15)相比,si-DNMT1细胞(1.20〉和si-SAHH+si-DNMT1细胞(1.24)明显升高(P<0.05)。
FCM结果发现,染毒后各型(WT、si-NC、si-DNMT1,si-H19+si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1)细胞S期细胞比率,与WT未染毒细胞相比,均分别升高了33.6%、34.0%、34.6%、38.0%和60.2%(P<0.05),其中无论是否染毒,si-H19+si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1细胞S期细胞比率,与WT未染毒细胞相比,均明显升高(P<0.05);与WT细胞染毒后相比,染毒后si-SAHH+si-DNMT1细胞明显升高了22.6%(P<0.05),而si-H19+si-DNMT1细胞则未见明显差异(P>0.05)。转染与染毒有交互效应(P<0.05)。调整染毒因素为协变量,与WT细胞S期细胞比率的修正均数(1.24)相比,si-SAHH+si-DNMT1细胞(1.37)明显升高(P<0.05)。
结论:
1、BaP染毒后H19与SAHH的结合调控DNMT1,使其表达和活性升高。
2、BaP染毒促进SAHH和DNMT1结合,干扰H19进一步增强两者的相互作用。
3、H19/SAHH/DNMT1参与调控OGG1甲基化、DNA氧化损伤和细胞周期。