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地鳖虫(Eupolyphage sinensis),又名土鳖虫、土元等,昆虫纲(Hexapeda)蜚蠊目(Blattaria)鳖蠊科(Corydiidae)昆虫,为《中华人民共和国药典》记载的正品药材。地鳖虫在中药中被使用具有悠久历史,中国明代李时珍的《本草纲目》,东汉著名医学家张仲景的《金匮要略》和汉代的药物著作《神农本草经》等均有记载。地鳖虫历来都做为传统的活血化瘀类动物药,现代生化分子及药理试验也证明了地鳖虫具有抗凝血、抗肿瘤、抑制血小板聚集、溶解静脉血栓等药效。黄粉虫(Tenebrio molitor)俗称黄粉甲、面包虫,属于昆虫纲(Insect),鞘翅目(Coleopter),拟步甲科(Tenebrionide)粉甲属(Tenebrionini),原产于南美洲,属于仓库和贮藏害虫。因其营养成分高,营养含量居各类活体动物蛋白饲料之首,被誉为“蛋白质饲料宝库”。近年来,黄粉虫被逐步开发为宠物饲料,以及应用于人类的高级营养食品。地鳖虫和黄粉虫体内不仅含有丰富的蛋白质、脂肪、氨基酸和其它小分子次生代谢物,同时还含有丰富的纤维蛋白溶解酶类,分离纯化这些纤溶活性蛋白并研究它们的性质对开发新型溶栓药物具有重要的意义。本文首先研究了纤溶活性蛋白的检测方法：纤维平板法(fibrin plate method)和纤维蛋白酶谱法(fibrin zymography)。其中,纤维平板法可以用来快速地定性和半定量检测纤溶活性蛋白。本文对该方法中的几个关键因素做了详细的研究和探讨。纤维蛋白酶谱法是一种基于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的方法,我们通过对该方法中几个关键因素的研究和讨论,得到了一种有效而简便的方法,可以让蛋白分子量标准的深蓝色条带和纤溶蛋白激活物的透明裂解带同时在淡蓝色的背景下显示出来。此方法能快速的检测出未知样品中纤溶活性蛋白的种类、数量和分子量,从而为后期的纯化提供更有价值的信息。其次,我们从地鳖虫体内分离纯化出了一种纤溶活性蛋白。通过30%-70%的硫酸铵梯度沉淀、Sephacryl-S200-HR分子筛、DEAE-Sepharose-FF离子柱和Benzamidine-Sepharose-6B亲和纯化,最后分离出了地鳖虫体内含量最大的一种纤溶活性蛋白,该蛋白被命名为ESTL。最终的纯化度为63.4倍,产量为9.7%,产物活性为1153U/mg。通过SDS-PAGE在完全变性条件下分析,该蛋白的分子量为22.8kDa,该分子量与纤维蛋白酶谱法得到的结果基本吻合。ESTL的pH稳定度较差,其只能在一个较窄的pH(6.0-10.5)范围内相对稳定,当pH值小于4.0或者大于11.0时,其活性迅速衰减。ESTL活性的最适pH值为9.5。ESTL的热稳定性也比较差,其在温度40℃以上保存1小时后活性会迅速衰减。但是在短时间活性测定时,其活性的最适温度为45℃。ESTL同时受丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)和胰蛋白酶抑制剂(TLCK, BPTI and benzamidine)所抑制,但是不受半胱氨酸蛋白酶(E-64)抑制剂和金属蛋白酶抑制剂所抑制(EDTA)。金属离子Na+和K+对ESTL的活性不产生任何影响,但是高浓度的Mg2+或Ca2+会对其产生部分抑制。本文还克隆了ESTL的基因并对该蛋白的三维模型进行了构建。首先通过保守区引物扩增出一条大小为450bp的片段,3’RACE法扩增到一条620bp的3’端片段,5’RACE法扩增到一条800bp的5’端片段。最后通过拼接得到ESTL的cDNA序列全长932bp,开放阅读框含762个碱基,编码254个氨基酸。序列在NCBI的登录号为：基因JN662341,蛋白AEQ55298。蛋白序列的前30个氨基酸为信号肽序列,成熟肽序列含224个氨基酸,预测分子量为22.4kDa,等电点为8.9。利用SWISS-MODEL工作平台对ESTL进行相似性建模,ESTL的三维结构由一个PDB号为1pq7的结构为基础建立起来。ESTL具有典型的丝氨酸蛋白酶的三元活性中心,包括。整个ESTL的三维结构可分为上下2个区,每个区各包含1个α螺旋和6个β折叠。2个区的中间由3条无规卷曲连接,并形成一个有柔性的代谢中心。最后,本文对黄粉虫纤溶活性蛋白进行了分离纯化。与地鳖虫纤溶活性蛋白分离纯化不一样的是,经过分子筛、离子柱、亲和纯化和金属螫合等分离后,具有纤溶活性的组分通过SDS-PAGE检测为两条带,而不是单一的一条带。这两个黄粉虫纤溶活性蛋白的分子量为27.5kDa和24.9kDa,分别命名为TMTL-Ⅰ和TMTL-Ⅱ。当pH高于11.0或者低于4.0时,TMTL的活性会迅速衰减。相对来说,TMTL在碱性条件比在酸性条件下的稳定要高。TMTL在pH8.0时拥有最高的活性。在pH8.0条件下进行了温度对TMTL稳定性影响的测定。测定结果表明TMTL在温度高于40℃时很不稳定。TMTL受到丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)和胰蛋白酶抑制剂(TLCK)的抑制。但是半胱氨酸蛋白酶抑制(E-64)和金属蛋白酶抑制(EDTA)几乎不影响TMTL的活性。从这些结构可以得知,TMTL属于丝氨酸类的胰蛋白酶,而不是金属蛋白酶。Na+,K+和Zn2+几乎对TMTL的活性无影响,而高浓度的Mg2+和Cu2+则会对TMTL产生一定的抑制效应,但是其抑制效应较低,Ca2+在所测试浓度范围内能促进TMTL的活性。同时,参照地鳖纤溶酶ESTL基因序列的简并引物,克隆到了黄粉虫纤溶活性蛋白,命名为黄粉虫类胰蛋白酶(Tenebrio molitor Trypsin-like enzyme,TMTL)。TMTL全长为869bp(GenBank序列号为JN662461),开放阅读框为777bp,编码258个氨基酸,并具有Trypsin-like特有的起始位点、活性中心以及预计底物结合位点。前16个氨基酸为信号肽序列,成熟肽序列含242个氨基酸,预测分子量为26.77kDa,等电点为8.5。经过比对分析,该基因编码的氨基酸序列与多种昆虫如赤拟谷盗、谷蠹、光亮扁角水虻、美洲大蠊的胰蛋白酶或丝氨酸蛋白酶有较高的相似性。同时对利用pET28a(+)、大肠杆菌BL21原核表达体系对黄粉虫类胰蛋白酶进行原核表达,再进行目标蛋白的纯化以及初步复性。为昆虫类胰蛋白酶的提取以及研究提供更为广泛的研究材料以及研究依据。