论文部分内容阅读
目的:阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS）是继发性高血压的常见病因,好发于肥胖人群,其发病机制较为复杂,可能是由于反复的缺氧后再次低通气使交感神经、RAS系统过度激活,导致血管内皮细胞损伤、炎症反应、脂质代谢紊乱等一系列内环境紊乱,从而引起血压升高。目前有观念提出肥胖和高血压均是一种炎症反应性疾病,并有研究证实TLR4相关信号通路的激活在OSAHS引起的高血压起到了重要作用。本课题组前期研究研究证实银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract,GBE）可抑制OSAHS合并高血压模型大鼠炎症水平,并具有降低血压的作用,因此本课题组通过建立OSAHS合并高血压模型脂肪细胞,在细胞、分子水平进一步观察GBE对OSAHS引起的高血压的治疗作用,探讨其可能与脂肪细胞TLR4介导的JNK信号通路和炎性因子之间的关系。方法:实验分为三部分。第一部分:雄性Wisatar大鼠随机分为常氧对照组（NC组）、间歇缺氧模型组（IH组）、银杏叶提取物治疗组（GBE组）,每组10只。GBE组每天灌胃银杏叶提取物水溶剂1mL/kg,NC组和IH组每天灌胃同等剂量的生理盐水,IH组和GBE组每天予以8h的间歇性缺氧处理,实验前后动态监测尾动脉血压变化及生理活动状态;9周后模型建立成功后采用常规酶消化法[1]和改良后的提取方法提取并培养前脂肪细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化、流式细胞仪检测细胞周期,油红O染色法鉴定,用MTT检测不同浓度的GBE作用不同时间后对前脂肪细胞生长的影响。第二部分:OSAHS合并高血压模型脂肪细胞分为模型对照组（IH组）、脂多糖诱导组（IH+LPS组）、TLR4阻滞剂组（IH+TAK242+LPS组）、JNK阻滞剂组（IH+SP600125+LPS组）,PCR和Western Blot分别检测TLR4、JNKmRNA和蛋白的表达情况,ELISA法检测TNF-a、IL-1β、IL-6含量。第三部分:OSAHS合并高血压模型脂肪细胞分为模型对照组（IH组）、脂多糖诱导组（IH+LPS组）、治疗组（IH+GBE组）、治疗后脂多糖诱导组（IH+GBE+LPS组）,PCR和Western Blot分别检测TLR4、JNKmRNA和蛋白的表达,ELISA法检测TNF-a、IL-1β、IL-6水平。结果:第一部分:（1）模型组大鼠逐渐表现嗜睡、鼻唇颜色稍暗紫、发出类似猫喘声等改变,血压逐渐升高（P<0.05）;治疗组血压没有明显的波动;（2）原代前脂肪细胞12h左右贴壁,24h伸展呈长梭形,3-5d进入对数期呈鱼群状生长,8d可长至融合,成脂诱导后胞内逐渐出现折光颗粒并汇聚成滴,胞核被挤向一侧,油红O染色后折光颗粒可被染成橘红色;（3）流式细胞仪检测提示采用传统酶消化法和改良后的提取方法原代细胞均具有增殖分裂能力,且改良法提取的细胞分裂能力增加;（4）GBE对前脂肪细胞生长有促进作用,在100mg/L、12h细胞的增殖活性最大、毒性最小。第二部分:IH+LPS组TLR4、JNK mRNA的表达明显高于其他三组（P<0.05）,IH+TAK242+LPS组较IH+SP600125+LPS组TLR4、JNKmRNA水平降低（P<0.05）,蛋白及炎性因子结果同PCR基本一致。第三部分:IH+GBE组的TLR4、JNKmRNA低于其他几组（P<0.01）;与IH+LPS组比较,IH+GBE+LPS组TLR4、JNKmRNA降低（P<0.05）,Western Blot及ELISA结果同PCR基本一致。结论:（1）改良酶消化法的消化液配置和消化条件可提高前脂肪细胞分裂能力;（2）银杏叶提取物对前脂肪细胞生长有时间、浓度依赖性;（3）TLR4介导的JNK信号通路参与了OSAHS所致高血压的发生过程中有一定作用,该信号通路的激活与炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平呈正相关;（4）银杏叶提取物可能是通过抑制脂肪细胞TLR4介导的JNK通路,下调炎性因子的分泌发挥降压作用。