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枣是我国特有果树资源,在区域经济发展中占有重要地位。在长期栽培过程中,枣产生了大量的遗传变异,其中,不乏许多优良品种和类型。枣是拟核果,大部分品种的果实有核,极个别品种无核,无核品种无论鲜食还是加工均很方便,无核是一个优良性状。无核金丝小枣是金丝小枣的果实无核自然突变体,除果实无核外,其枝叶形态和花果特点与金丝小枣相同。本研究对枣果实无核机理进行了系统的研究。以无核金丝小枣和金丝小枣为试材,利用光学显微镜和透射电镜观察果核发育过程中果核细胞的显微结构和超微结构;测定果核发育的生理生化指标及与其形成相关酶(PAL、POD和PPO)活性;应用cDNA-AFLP技术,分析与果核相关基因的差异表达。开展枣果实无核机理的研究,对开发利用这一资源和用基因工程培育更优良的无核枣品种奠定基础。通过本论文的研究工作,得到如下的结果:
1.无核金丝小枣与金丝小枣果实发育的纵径、核厚、核重的变化呈现双S曲线的的趋势。无核金丝小枣果实横径发育呈单S曲线的趋势,而金丝小枣为双S曲线。在果实成熟时除纵径二者差异不显著外,果实横径、果种、核厚、核重,无核金丝小枣均显著低于金丝小枣的相应值。
2.无核金丝小枣与金丝小枣果核发育均分为三个时期即:果核发育前期、果核发育中期、果核发育后期。
3.无核金丝小枣果核发育的解剖学特征与金丝小枣的主要差异在于:(1)在果核发育中期无核金丝小枣果核的内层和近内层细胞停止分裂,细胞壁未木质化仍为薄壁细胞;而金丝小枣果核细胞持续快速分裂,细胞壁木质化成为厚壁细胞。(2)在果核发育后期无核金丝小枣果核细胞木质化程度较金丝小枣低,与金丝小枣整个细胞被木质填充不同,而是形成细胞壁木质化的空腔,并且细胞间隙也为空的腔隙,切片观察成筛网结构,这一构造特点形成了无核金丝小枣果核薄而可食的优良特性。
4.无核金丝小枣只是在形态上残存果核,与严格意义的无核不同。果核细胞层数少,核层细胞的细胞壁木质化程度低,果核薄成膜质。
5.在果核发育中期,无核金丝小枣果核内酚类物质的低含量,减缓了果核木质素的合成速度。进入果核发育后期,较低的木质素含量降低了无核金丝小枣果核的木质化程度。
6.在果核发育的中期和后期,无核金丝小枣果核内PAL、POD和PPO的活性均低于金丝小枣,降低了果核木质素的合成速率。
7.本研究建立了适合枣果实cDNA-AFLP技术体系:在20μL酶切体系中,包括cDNA模板150ng,NEB buffer2μL,BSA(10mg/mL)0.2μL,EcoR I(大连宝生物公司)3U,Mse I(NEB公司)3U,加ddH2O至20μL;37℃酶切5h;加上接头,37℃连接10h(或过夜);连接产物稀释5倍进行预扩增;预扩增产物稀释10倍进行选择性扩增;加入10μL Loading Buffer,95℃变性10min,立即冰浴;在6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行电泳分析;银染法检测PCR产物。
8.以无核金丝小枣为试材,金丝小枣为对照,提取总RNA,利用cDNA-AFLP技术分析与枣果实无核相关基因的差异表达,共获得3条TDFs,DC1,DC5和DC9。这3条TDFs在枣上均为首次报道。DC1和DC5在GenBank中均未发现有与之显著相关的同源序列,推测它们可能是功能未知的新基因,其功能有待进一步验证。DC9在GenBank中经过Blast比对发现其与蓖麻(Ricinus communis)水解酶有显著同源性,E值为9e-32,水解酶具有降解木质素的功能,因此证明DC9是于枣果实无核相关的TDFs。
9.结合无核金丝小枣和金丝小枣果核cDNA-AFLP分析结果、解剖学观察结果和生理生化研究的结果我们可以得出DC9片段是与枣果实无核形成密切相关的一条基因片段,DC9的特异性表达,产生了水解酶,不断的降解木质素,而木质素生物合成具有多途径性,并不能完全抑制木质素的合成与沉积,所以DC9基因片段是无核金丝小枣产生无核现象原因之一。DC9基因片段的获得为通过基因工程培育出新的无核品种奠定了基础。