目的:1、体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(rat Marrow Stem Cells, rMSCs)2、检测大鼠骨髓间充质干细胞p38MAPK对应力刺激的早期反应3、摸索四点弯曲应力加载仪对骨髓间充质干细胞作用的适宜条件例如应力大小作用时间作用力的方式方法:1、取材:选取3周龄SD大鼠雌雄不限100-120克,暴露双侧股骨及胫骨全长,抽取全骨髓细胞;2、大鼠骨髓间充质干细胞分离培养纯化:全骨髓细胞吹打离心去上清加培养液吹打后10cm培养皿培养,细胞培养条件为低糖DMEM(含10%灭活滤菌胎牛血清、青霉素G100U/L、链霉素100ug/ml),37℃、5% CO2孵箱;0.25%Trypsin-EDTA消化细胞传代;倒置相差显微镜观察细胞生长状态;本实验选用第三代骨髓间充质干细胞;3、实验分组:观察不同应力强度对骨髓间充质干细胞的作用空白对照、1000μ、2000μ、3000μ、4000μ、5000μ、6000μ;观察细胞内p38MAPK对应力刺激的早期反应分为张应力组4000μ(空白对照、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟),压应力组4000μ(空白对照、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟);4、应力加载:选择第三代骨髓间充质干细胞制作细胞爬片,细胞爬片生长24小时后根据分组进行应力加载,加载完毕进行蛋白提取处理保存;5、Westorn Blooting方法检测细胞内磷酸化p38MAPK及总p38MAPK表达:测蛋白浓度、根据蛋白浓度计算上样量、电泳、转膜、封闭、孵育抗体、发光照相、灰度分析;6、统计学方法:统计数据采用SPSS 13.0软件进行分析,各组间比较采用进行单因素方差分析,概率<0.05有统计学差异。结果:1、对第三代大鼠骨髓间充质干细胞施加15分钟频率0.5Hz微张应力刺激应力大小分别为0、1000μ、2000μ、3000μ、4000μ、5000μ、6000μ,应力强度2000μ、3000μ、4000μ对细胞内p38MAPK有明显的激活作用,其中4000μ激活作用较强;2、对大鼠骨髓间充质干细胞施加频率0.5Hz强度4000μ的周期性张应力刺激,对细胞p38MAPK早期激活作用最强出现在15分钟其次为5分钟,空白对照组细胞p38MAPK基本没有被激活,与空白对照组比较30分钟和60分钟的持续刺激对p38MAPK的激活作用没用明显差异。对间充质干细胞施加4000μ的压应力刺激,5分钟15分钟30分钟刺激对细胞p38MAPK均具有明显激活作用与空白对照组相比具有显著差异,激活作用最强出现在15分钟。结论:大鼠骨髓间充质干细胞(rat MSCs)为机械应力刺激敏感细胞, p38 MAPK参与了大鼠骨髓间充质干细胞对微张应力刺激作用引起的信号转导,强度4000μ时间15分钟的机械应力刺激对大鼠骨髓间充质干细胞p38MAPK信号通路具有较强激活作用。