随着临床与紧急事故中快速止血需求的不断增加,新型止血敷料设计与开发已成为当前的研究热点。人发角蛋白作为一种天然的生物材料,具有优异的止血、创伤修复、生物相容性和降解性,被广泛的应用于生物医学领域。针对人发角蛋白提取物成分复杂、质量及氨基酸组成难以控制等局限性,本课题组对Ι型人发角蛋白K37进行了重组表达与纯化,并首次证明了K37重组蛋白同样具备良好的止血性能。然而,人发角蛋白K37序列中有效的止血功能区域并不明确,并且由于角蛋白天然不可溶,重组角蛋白也为不溶性的包涵体。因此,研究人发角蛋白的止血功能区域以及通过基因改造提高重组角蛋白的溶解性对于新型止血蛋白材料的开发与设计具有重要意义。本课题通过截取重组角蛋白K37中序列最长、包含氨基酸信息最全面的第三个α-螺旋结构即K37-3α序列作为研究模型,并通过基因改造得到了CMK37-3α序列以增加重组角蛋白的可溶性,并利用重组蛋白异源表达技术对K37-3α及CMK37-3α两种重组蛋白进行了表达、纯化与理化表征。再采用静电纺丝技术与涂层法制备了一种新型的止血敷料—重组角蛋白/聚己内酯纤维复合膜,进而来考查K37-3α及CMK37-3α重组角蛋白的止血性能。主要研究内容和结论如下:(1)截取角蛋白K37中的第三个α-螺旋结构即K37-3α,利用重组蛋白异源表达技术,对其进行了表达、纯化及理化性质表征。冻干后K37-3α粉末的平均产量为120.22 mg/L,而其水溶性部分的平均产量仅为6.496 mg/L。通过生物信息学分析、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS、UV-vis、FT-TR、CD及XRD等理化手段分析可知:K37-3α重组角蛋白目的条带清晰且单一、浓度较高、表达产物是不可溶解的包涵体,其实际分子质量为16.339 KD。此外,K37-3α也具有蛋白质本身的紫外及红外特征吸收峰,基本化学结构与K37极其相似,并且其二级结构中基本上仅包含α-螺旋,同时K37-3α也是以无定形结构的形式存在的。(2)为了满足临床止血的功能需求,对K37-3α序列进行基因改造,并利用重组蛋白异源表达技术,对改造后的新序列即CMK37-3α进行表达、纯化及理化性质的鉴定。冻干后CMK37-3α粉末的平均产量为36.18 mg/L,其溶解后的平均产值为29.43 mg/L。由上述理化表征可知:CMK37-3α重组角蛋白的目的条带单一清晰,纯度较高,其实际分子质量为17.459 KD,其表达产物水溶性极好。此外,与K37-3α重组角蛋白相比,改造前后重组角蛋白的结构及理化性质基本没有发生变化。(3)将K37-3α及CMK37-3α重组角蛋白用30%的甲酸溶解后,利用静电纺丝技术及涂层法制备重组角蛋白/聚己内酯纳米纤维复合膜。通过SEM、FT-TR、XRD、断裂拉伸及接触角等分析方法对纤维复合膜进行测试,并通过体内外凝血实验考察了纤维复合膜的止血性能。结果显示:在静电纺丝过程中,当PCL溶液的质量分数为10%时纺丝最顺畅,所得纤维最均匀,平均直径为439.89±27.54 nm。在涂层的过程中,当角蛋白浓度为2 mg/mL时,涂层效果最好,并且重组角蛋白与PCL纤维膜之间并没有发生化学反应,而是形成了氢键;同时,纤维复合膜的结晶度有所下降,表明两者在甲酸作为溶剂的条件下相容性良好;此外,其亲水性能增加,而杨氏模量值却有所下降,但也与其他聚己内酯/天然聚合物基纤维复合膜的力学性能相当。体外促凝血实验发现,重组角蛋白可以增加血红蛋白的粘附,促进血小板的活化及聚集,激活一系列级联酶促反应。同时,K37-3α及CMK37-3α重组角蛋白/PCL复合膜在SD大鼠肝脏和股动脉损伤出血模型中可显著缩短出血时间和减少出血量,其中CMK37-3α复合膜的效果最佳。(4)将L-929细胞接种于重组角蛋白/聚己内酯纤维复合膜的表面考察了止血敷料的细胞相容性能。通过MTT、Calcein-AM/PI双染和SEM等方法进行了评估。结果显示,K37-3α及CMK37-3α重组角蛋白/PCL纤维复合膜对细胞无毒性并且与细胞相容性良好,尤其是CMK37-3α重组角蛋白的加入能够进一步促进细胞的生长与增殖。综上所述,人发重组角蛋白K37的第三个α-螺旋片段是K37的有效止血功能区域,并且其经过基因改造后极大的改善了K37-3α重组角蛋白的溶解性,进一步增强其止血效果,这为后续对K37中其余两个α-螺旋结构的止血性能研究及止血关键位点的探寻奠定了理论基础,也为新型止血药物的开发提供了新的思路。