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第一部分：Canonical transient receptor potential channel(TRPC)6是钙通透的非选择性阳离子通道,其phospholipase C(PLC)依赖的受体激活信号传导途径参与了众多包括细胞生长增殖在内的生理调节功能,研究TRPC通道对于理解肿瘤发生发展的机制,发现新的治疗靶点具有极大的现实意义。近年有报道表明TRPC6通道在前列腺癌、肝癌和乳腺癌中存在高表达,然而TRPC6通道在其他肿瘤中是否也同样存在高表达以及它在肿瘤细胞中的激活机制仍然不清楚。
经过筛查我们发现在食管癌,胃癌和胶质瘤中存在TRPC6的高表达,为了研究在这些肿瘤细胞中是否存在功能性的TRPC6通道,我们构建了腺病毒载体的功能失活型的TRPC6质粒,并结合电生理,细胞内钙成像技术和药理学工具,研究肿瘤细胞中TRPC6的激活机制。我们发现:uridine5-triphosphate(UTP)在食管癌细胞系Eca109中能引起TRPC6依赖的膜电流和细胞内钙信号,platelet-derived growth factor(PDGF)和Histamine分别在胶质瘤细胞U87和胃癌细胞系MKN45中激活TRPC6介导的细胞内钙信号。以上三种肿瘤细胞的钙信号均包含内钙释放和外钙流入两种成分,而TRPC6介导了内钙释放清空激活的外钙流入成分。因此我们提出,TRPC6在其高表达肿瘤细胞中普遍以SOC(store-operated channels)的形式起功能性作用,对肿瘤细胞的增殖起到促进作用。
第二部分：经典瞬时受体电势通道6(TRPC6)通道在神经元树突棘发育过程中的功能性研究
G蛋白耦联受体和酪氨酸激酶受体启动的相关信号途径在中枢神经系统参与了突触可塑性变化,同时这两种受体的激活可以激活PLC产生diacylglycerol(DAG)激活TRPC通道,而TRPC通道在中枢神经系统有着丰富的表达,由此引发的问题是:TRPC通道是否参与了对神经元突触形成的调节?
通过Western-blot、免疫细胞化学和免疫电镜技术,我们发现:出生后2-4周海马神经元的突触存在TRPC6蛋白的高表达,并且TRPC6蛋白主要表达于突触后。为了研究TRPC6通道主要表达于突触后的功能意义,应用电生理技术记录突触后神经元不同TRPC6蛋白表达水平下的微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory post synaptic potential,mEPSC),同时结合免疫细胞化学方法观察触后神经元不同TRPC6蛋白表达水平下的突触形态学表征。我们发现,用针对TRPC6的RNAi质粒抑制TRPC6蛋白水平会抑制mEPSC的频率,但如果同时表达耐受RNAi质粒的TRPC6质粒能够挽救这种抑制；过表达TRPC6蛋白能使海马神经元树突棘以及兴奋性突触的密度明显增加,用针对TRPC6的RNAi质粒抑制TRPC6的蛋白水平则会抑制神经元树突棘以及兴奋性突触的密度,而在表达RNAi质粒的同时表达耐受RNAi质粒的TRPC6质粒RR-TRPC6则会挽救这种抑制。由此我们证明了TRPC6通道有促进神经元兴奋性突触形成这一新的功能。