论文部分内容阅读
猪链球菌病是一种重要的人兽共患传染病,能导致仔猪脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎和人的脑膜炎,已成为严重危害养猪业的一种重要疫病,并对公共卫生尤其是相关从业人员的生命安全构成威胁。由于抗生素滥用等原因,猪链球菌的耐药性越来越严重,给该病的防控带来了困难。噬菌体具有高效裂解细菌的特性,逐渐成为一种颇具潜力的杀菌制剂,而噬菌体的裂菌机制主要基于其穿孔素-裂解酶裂解系统,本文通过重组表达、制备了具有生物学活性的猪链球菌噬菌体裂解酶LySMP,并对该酶的制备和生物学活性检测的规程进行了研究。为了获得具有生物学活性的猪链球菌噬菌体裂解酶LySMP,采用大肠杆菌重组表达技术,将PCR扩增的猪链球菌噬菌体SMP的裂解酶基因,插入pET-28a(+)中,构建出重组表达载体Lysin-pET-28a。将该载体导入到大肠杆菌BL21细胞中,IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE电泳分析,确认获得分子量为55kDa的LySMP融合蛋白。优化了诱导表达蛋白的温度、时间和IPTG浓度,表达产物经纯化后,可获得5mg/mL的LySMP蛋白。通过比较LySMP在不同条件下对细菌裂解导致浊度递减的百分数,确定了LySMP的最适工作条件。结果表明,LySMP在37℃,pH7.2的条件下,裂菌效率最高。测定了实验室保存且常用的9株猪链球菌的生长曲线,获得了生长对数期各菌株的细菌数,在LySMP作用于各菌株后,测得细菌的死亡率达4.6%-36%。同时测定了LySMP对沙门氏菌、李斯特菌、鹑鸡肠球菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌和松鼠葡萄球菌等致病菌的裂解效果,结果显示在加入LySMP作用15分钟后,细菌浊度下降1.7%-12%。此外,通过优化裂解酶纯化策略,纯化后的LySMP具有良好的裂菌活性,添加0.8%β-巯基乙醇,裂菌效率无明显提高,故可不添加还原剂。为了规范裂解酶的制备和使用,对裂解酶的裂菌活性进行了定义。将LySMP倍比稀释,通过浊度递减实验,使细菌浊度下降50%的稀释度的倒数即定义为LySMP的一个活性单位(unit/mL)。例如,2.8mg/mL的纯化LySMP稀释至1：2560时,可使SS2-4的OD600值下降50%,则其裂菌活性为2560 unit/mL,每单位所含的LySMP量为0.9μg。鉴于噬菌体裂解酶对温度敏感,研究LySMP的保存条件非常重要。研究发现,LySMP在不同温度条件下,保持酶活性的时间差异较大,37℃条件下30min即失去活性,4℃可保存一周,-20℃和-80℃可保存两周以上,但活性稍有下降。在-20℃和-80℃的冷冻条件下,25%的甘油可较好保持LySMP的酶活性。为了达到长期保存裂解酶的目的,对其冷冻干燥工艺进行了研究。利用正交实验设计的原理和方法,对LySMP冻干保护剂进行了筛选,直接分析和方差分析的结果表明,保护剂最优组合为：18%蔗糖、6%葡萄糖、0.5%甘氨酸、0.8%山梨酸钾和25%甘油。利用优化的保护剂,可使冷冻干燥的LySMP维持40%的裂菌活性。