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目的通过自制氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)模型诱导体外培养新生大鼠皮层神经元凋亡的方法，观察apelin-13对氧糖剥夺诱导神经元凋亡的抑制作用、促进神经元存活的保护作用以及对环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)/蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)/cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive elementbinding protein, CREB)信号转导通路活性的影响，探讨apelin-13对氧糖剥夺诱导神经元凋亡抑制作用的相关机制，以期为缺血性脑卒中的治疗提供实验方法和理论依据。方法1.新生大鼠原代皮层神经元培养并纯化，经神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)免疫细胞化学鉴定，计算纯度。2.建立原代培养神经元氧糖剥夺模型，并验证其有效性：原代神经元培养至第7天换无糖Earle′s液培养，并覆盖灭菌液体石蜡（氧糖剥夺模型），于培养第6、9、12、24、30h不同时间点，分别进行倒置显微镜下观察、微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein-2, MAP-2)荧光染色、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量检测、原位末端转移酶标记法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,Tunel)检测凋亡细胞，通过上述方法验证模型有效性，并筛选出致凋亡率最高的时间点作为本研究实验观测时间点。3.确定apelin-13是否能对体外培养皮层神经元氧糖剥夺诱导的凋亡具有抑制作用：10nmol/L、1nmol/L、0.1nmol/L的apelin-13分别预处理神经元30min后，施加OGD损伤，同时再加入上述浓度apelin-13继续培养12h，采用倒置显微镜下观察、MAP-2荧光染色、LDH检测、Tunel和神经元特异性核蛋白(Neuron-specific NuclearProtein, NeuN)及Hoechst33342染色、Real Time RT-PCR等方法，分别观察OGD损伤后神经元的形态、大致死亡情况、计算凋亡细胞比例、观察存活神经元以及检测caspase-3、bcl-2和bax的表达水平，以确定apelin-13是否对氧糖剥夺诱导神经元凋亡具有抑制作用。4.酶免疫分析法检测apelin-13对各组细胞中cAMP表达的影响，并与阳性对照磷酸二酯酶4(phosphodiesterase4, PDE4)抑制剂Rolipram进行比较。5.加用终浓度为10μmol/L的PKA抑制剂H89，Western Blot检测各组细胞中phospho-CREB的水平，观察PKA抑制剂对CREB磷酸化水平的影响，从而确定apelin-13对cAMP/PKA/CREB信号通路的影响以及对此信号通路的影响是否是PKA依赖的。结果1.新生大鼠原代皮层神经元培养至第7天，经神经元特异性烯醇化酶鉴定，神经元比例为(90±6.164414)%，为相对纯的神经元培养物，可用于进一步实验。2.氧糖剥夺模型制备后，倒置显微镜下观察及MAP-2荧光染色可见神经元有明显损伤。LDH检测显示随OGD时间延长，LDH漏出进行性增多并呈时间依赖，细胞死亡增多。Tunel染色显示OGD12h组神经细胞凋亡率为52.83±3.53%，明显高于其他组，故以OGD12h作为本研究中的实验观测时间点。3.OGD损伤给予apelin-13干预后，倒置显微镜下观察及MAP-2荧光染色显示apelin-13能促进神经元存活，LDH检测显示LDH释放量减少(P<0.01)。Apelin-13能够抑制OGD诱导的皮层神经元凋亡：Tunel染色显示apelin-13能降低凋亡神经元比例(P<0.05)；Real Time RT-PCR结果显示apelin-13能够降低caspase-3的表达(P<0.05)，降低bax的表达(P<0.01)，增加bcl-2的表达(P<0.05)。4.阴性对照组apelin-13干预3h后，细胞内cAMP水平未见明显改变(P＞0.05)；OGD给予apelin-13干预3h后，细胞内cAMP水平明显增高(P<0.01)，与Rolipram作用相似；但OGD同时给予apelin-13和Rolipram，细胞内cAMP升高的水平反而降低，明显低于OGD+apelin-13或OGD+Rolipram组(P<0.05)。5.阴性对照组apelin-13干预3h后，细胞内p-CREB水平未见明显改变(P＞0.05)；OGD组较正常对照组p-CREB水平明显降低(P<0.01)；OGD施加apelin-13干预3h后，细胞内p-CREB水平明显增高(P<0.05)；但OGD同时给予apelin-13和H89，p-CREB水平明显降低(P<0.01)。结论1.采用无糖Earle′s液培养神经元并覆盖灭菌液体石蜡隔氧，可以制备氧糖剥夺模型，能够有效诱导体外培养神经元凋亡；2.Apelin-13可抑制氧糖剥夺诱导的神经元凋亡；3.Apelin-13抑制凋亡的作用可能与cAMP/PKA/CREB信号通路有关。