先天性心脏病（简称先心病,Congenital Heart Disease,CHD）是胎儿畸形中常见的一类,极大危害人类的生命健康。叶酸（Folic Acid,FA）是13种必需维生素之一,在心血管发育中发挥重要作用。因为它是甲基化反应、核苷酸合成和维持同型半胱氨酸在无毒水平所必需的重要维生素。叶酸代谢不足将导致蛋氨酸循环受阻和高同型半胱氨酸血症（Hhcy）。Hhcy是先天性心脏病的一个独立危险因素。研究表明叶酸缺乏会影响大脑、肝脏等器官的发育,导致各种疾病的发生。怀孕期间补充叶酸预防先天性疾病的发生已成为共识,然而,Plumptre等人2015年报道统计显示存在孕妇过量补充叶酸的现象。因此,评估叶酸的缺乏和过量对器官发育的影响是非常必要的。叶酸合成基因5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）的突变与先天性心脏病的发生有关,孕期叶酸摄入量低和叶酸代谢中常见的遗传变异（亚甲基四氢叶酸还原酶,677 C＞T,白种人中约15%为同型,20%为异型,中国北方约17%为同型,23%为异型）,可能导致不同程度的胎儿发育不良。研究表明叶酸缺乏会影响神经管闭合等胚胎发育过程,但叶酸影响心脏发育的机制目前还不清楚。鉴于叶酸和MTHFR基因在生物器官的早期发育中所起的重要作用,本研究使用不同浓度的叶酸（FA）和叶酸抑制剂甲氨蝶呤（MTX）对斑马鱼胚胎进行暴露处理,暴露时间选择在斑马鱼神经管闭合后的16 hpf（hour post fertilization）至36hpf进行,旨在模拟人类神经管闭合后的孕中后期阶段,来探究叶酸补充过量或不足对胚胎早期心脏发育的影响。我们首先测定了叶酸和MTX对斑马鱼胚胎的半数致死浓度LC50,依据LC50值各设置5组浓度观察表型,发现叶酸FA过量与抑制剂MTX均对斑马鱼心脏发育呈现剂量依赖性影响。通过石蜡切片和荧光标记心肌细胞及心内膜的转基因斑马鱼Tg（cmlc2:EGFP;kdrl:mCherry）开展进一步实验,本文发现使用叶酸拮抗剂MTX的斑马鱼胚胎心脏出现结构异常,叶酸不足会导致心室心肌相较于对照组增厚39.6%,叶酸过量暴露导致斑马鱼心脏环化角度相较于对照组增大62.12%。除此之外,叶酸拮抗剂暴露和叶酸暴露剂量的增加也可引起斑马鱼胚胎血管发育异常以及出现运动迟缓的现象。但心脏是最早观察到的异常发育器官之一,并且叶酸对斑马鱼心脏发育的影响存在剂量依赖性。随后本研究利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼叶酸还原酶mthfr基因敲除模型,以探索叶酸对胚胎心脏发育的剂量依赖性影响和分子机制。本文通过同型半胱氨酸（Hcys）测定实验发现,叶酸代谢异常导致了斑马鱼体内Hcys升高累计达142μmol/g,重硫酸氢盐测序（BSP）实验显示hand2基因启动子甲基化程度相较于叶酸正常代谢组增加了10.50%～21.05%。Hcys增高和hand2基因甲基化异常可以导致包括先天性心脏病在内的各种先天性疾病的风险增加。此外,本论文q PCR和原位杂交实验结果显示叶酸异常代谢及mthfr基因突变,导致了心脏发育关键基因hand2、gata4的表达量和表达位置的变化。同时引起了S-腺苷蛋氨酸（SAM）的增加,和hand2基因启动子区域甲基化程度的变化。综上,本论文实验结果表明叶酸代谢受阻和过量补充叶酸对生物体的早期发育存在负面作用,叶酸对斑马鱼早期心脏发育存在剂量依赖性影响。本研究揭示了精确剂量的叶酸补充对于生物体早期心脏发育至关重要,挖掘了mthfr基因在心脏中的功能,加深了目前对叶酸与早期心脏发育关系的理解,为叶酸精准剂量的补充提供了一定的科学依据。