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现代自由基生物学及自由基医学研究表明,生物体系中活性氧(ROS),尤其是氧自由基是生物体内有关酶促系统需氧代谢过程或线粒体电子传递链中电子传递的中间产物,同时它还是生物体组织或细胞经历某些病理损害过程的中间产物。在正常代谢状况下,细胞内产生的活性氧自由基和细胞本身对该类自由基的清除处于一个稳态平衡。无论体内自由基产生过多,或清除能力的过低,都会导致诸多疾病的产生、发展或恶化。目前,探测自由基最直接有效的方法当属自由基捕获技术配合电子自旋共振(Spin Trapping-ESR)。以往大量的ESR研究中,科研工作者一直致力于开发高效的捕获探针,特别是针对超氧阴离子自由基的探测,并且得到了一些性能优良的探针试剂,但它们在生物学应用中仍存在很多的局限。因此,设计与合成针对活性氧,特别是超氧阴离子自由基具有更高捕获效能同时又具有较强的加合物稳定性的自由基探针具有重要的研究价值。
在此研究背景之下,我们通过实测探针捕获超氧阴离子的速度以及它们与超氧阴离子所生成加合物的稳定性,提出并建立衡量或评价探针优劣的分子结构参数,并以此对新型高效自由基探针的预测进行了有益的尝试。本文的主要具体研究成果如下:
1、α-苯基-N-叔丁基氮氧化合物(PBN)是一种应用广泛、效率较高的自由基捕获探针。因此,在PBN分子结构框架与应用基础上,设计并合成了八种不同取代性质的线性硝酮类探针分子,并用ESR分析了它们对自由基的捕获能力。结果表明:其中惟有链接磷酰基的四种探针可有效地捕获超氧阴离子自由基,但全部八种探针都可捕获到其它类型的活性自由基。
2、首次探索性地设计出一种新的超氧阴离子自由基捕获速度分析技术—NBT还原光谱法。此外,在理论方面提出应用更为简便、实用的LUMO轨道能作为超氧阴离子自由基对硝酮加成反应速度的判据,并发现LUMO轨道能与实测的捕获反应速度常数呈良好的负相关关系。
3、作者从量子化学DFT理论方法得出八种硝酮探针与超氧阴离子自由基生成的加合物的优化分子结构,提出分子内氢键,分子内非键相互作用以及立体保护作用是影响加合物稳定性的三要素。
4、在上述工作基础上,初步尝试了一种新型自由基探针TCPN的分子设计与合成。TCPN设计的出发点是链接三个强吸电子的氯原子以增加其捕获自由基能力,并且通过cis-TCPN-O2H的理论优化结构也显示它具有极强的分子内氢键(1.696(A))。TCPN捕获自由基的ESR实验也恰好显示出它具备优良的自由基探针性能:(1)通常在5-10mM浓度即可高效捕获多种活性自由基;(2)可捕获超氧阴离子自由基,且寿命τ1/2=25 min(pH=6.5);(3)它的ESR波谱参数与环状自由基加合物十分类似,易于根据超精细裂分常数表征多种自由基。