大肠杆菌中由argE基因编码的N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶(N-acetylornithine deacetylase，简称NAOase；EC3.5.1.16)，可选择性地作用于L-型酰基化氨基酸，且具有较广泛的底物特异性，能立体拆分消旋化氨基酸生产L-氨基酸。此外，对该酶的研究还具有理论意义和潜在的医药应用价值。迄今为止尚无NAOase三维结构的相关报道。　　 本文首先运用生物信息学软件分析NAOase的一级结构，即NAOase主肽链由383个氨基酸组成，理论等电点为5.54，相对分子质量为42kD。由于NAOase与已知金属酶ACDase，CPG2、DEPE、ACY1、YSCS同源，预测分析得NAOase也是一种金属酶，而且酶活力的表现依赖于锌离子的存在。　　 其次预测分析NAOase的高级结构及其活性中心的组成，分析其结构特点。NAOase属于肽酶M2OA家族ArgE亚家族，12-383肽段是肽酶M20/M25/M40特征区域。每条亚基由19个β折叠和13个α螺旋构成两个结构域，结构域间以170-180肽段构成的柔性链接区相连。酶的活性中心位置由4个β折叠形成中空，外绕6个长度不等的α螺旋，呈环绕的α/β拓扑结构，与M2OA族的ACDase，CPG2，DAPE结构相似。β折叠与邻近的α螺旋中的氨基酸相互作用，形成一个细小狭长且深的口袋，为底物专一结合区。该处主要由Asp82，Asp112，Glu144-145，His355构成，即Asp，Glu，His三种氨基酸为酶活性中心的重要氨基酸。其中Glu144，Asp82是催化位点，Glu144为质子受体，Hissss，Asp112，Glu145可能是底物结合位点。　　 本文通过对酶活性中心的金属离子的结合的研究，验证了NAOase确实是金属酶。制备SDS-PAGE电泳纯的纯酶是研究前提。NAOase是胞内酶，对于100mL10％的菌悬液，200W超声5s，间歇5s，全程10min是菌的最佳破碎条件。以硫酸铵分级沉淀进行酶液的粗分离，NAOase主要集中在40％～50％的硫酸铵级分内，然后采用Ni-NTA亲和层析进一步纯化，经阶段洗脱后可得SDS-PAGE电泳纯的酶。纯化过程的总回收率为38.3％，纯化倍数为59.9。采用硫酸铵沉淀和一步亲和层析分离得到电泳纯的NAOase，简化了纯化步骤。　　 其次，酶反应体系中金属离子的存在确实对酶活力有较大的影响。Co2＋对酶活力有明显促进作用，最适用量为0.1mmol/L；反应体系中外加Zn2＋、Ni2＋、Cu2＋对酶反应有明显抑制作用，Zn2＋离子浓度越高，抑制作用越强；Mg2＋、Mn2＋、Fe3＋对酶活的影响不大；低浓度的Mn2＋对酶活有促进作用。　　 第三，自然酶、Zn2＋脱辅酶及Zn2＋重构全酶的活力比较证实了NAOase为依赖于Zn2＋的金属酶。Zn2＋在酶分子内的作用类似于氨基酰化酶中，既维护酶分子活性部位的特定空间结构又参与酶和底物的反应过程，起电子传递作用。自然酶、Co2＋脱辅酶及Co2＋重构全酶活力的对比实验证明了Co2＋不参与活性中心的组成，可能在活性中心外起到传递电子和稳定酶分子构象的作用。　　 第四，考察酶活性中心重要氨基酸的组成及它们在活性中心的位置确定。采用苯甲基磺酰氟(PMSF)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、5，5-二巯基-2，2-二硝基苯甲酸(DTNB)、焦碳酸乙二脂(DEPC)、N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3’-sulfonate(WRK)五种化学试剂，分别选择性修饰NAOase中Ser的羟基、Trp的吲哚基、Cys的巯基、His的咪唑基、Asp/Glu的羧基，结果显示His和Asp/Glu为酶活性中心内的重要氨基酸，而Ser、Trp和Cys不参与酶活性中心的形成。其中，His对底物和酶的结合起关键作用，Asp/Glu参与形成酶的催化中心。　　 综上所述，本文综合多种生物信息学软件预测得NAOase为金属酶，其活性中心Asp，Glu，His三种氨基酸组成，其次采用亲和层析分离方法得到SDS-PAGE电泳纯的NAOase，考察金属离子对NAOase的影响后发现NAOase依赖于Zn2＋，活性中心存在Zn2＋结合位点。最后纯酶经化学修饰剂修饰的结果确定了NAOase活性中心由Asp82，Glu144，His80组成。本文在序列和结构分析的基础上对保守氨基酸进行化学修饰，提高了化学修饰的针对性，同时从序列和结构的角度对化学修饰的结果进行合理的解释。