【摘 要】
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外泌体是原核和真核细胞主动向胞外释放的纳米级(30-150nm)双层囊泡,携带蛋白质、脂质和多种遗传物质(如m RNA、lnc RNA、mi RNA和DNA等),可通过自分泌和旁分泌途径被细胞吸收,也可经循环系统被远距离靶组织或器官吸收,能参与机体多种生理和病理过程。目前,畜禽动物外泌体的研究多局限于乳汁、精液、子宫液和细胞培养上清液等液体,人们对猪不同组织外泌体中遗传物质的组成、品种间差异、生理
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外泌体是原核和真核细胞主动向胞外释放的纳米级(30-150nm)双层囊泡,携带蛋白质、脂质和多种遗传物质(如m RNA、lnc RNA、mi RNA和DNA等),可通过自分泌和旁分泌途径被细胞吸收,也可经循环系统被远距离靶组织或器官吸收,能参与机体多种生理和病理过程。目前,畜禽动物外泌体的研究多局限于乳汁、精液、子宫液和细胞培养上清液等液体,人们对猪不同组织外泌体中遗传物质的组成、品种间差异、生理作用及其可能影响表型的机制等方面尚不清楚。因此,本研究旨在通过分析品种间和组织间的外泌体RNA差异,发现潜在调控猪生理功能和细胞生物学进程的外泌体RNA。本研究利用蛋白酶消解、差速离心和尺寸排阻三种技术从2头20日龄野猪(1公1母)与2头20日龄商业大白猪(1公1母)的肌肉和肝脏组织中分离到外泌体,然后对肌肉组织外泌体进行全转录组(small RNA、lnc RNA和m RNA)测序,并对肝脏组织外泌体进行small RNA(s RNA)测序。之后,对组织外泌体RNA进行了分类注释和统计分析。通过分析两个品种间(野猪和大白猪)和两种组织间(肝脏和肌肉)的外泌体RNA表达谱差异,鉴定了不同种类的差异表达RNA,进而对差异m RNA以及差异lnc RNA和mi RNA的靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。此外,还探讨了肌肉外泌体RNA和肌肉组织中RNA的表达谱差异。主要结果如下:1.本研究从大白猪与野猪的肌肉和肝脏中成功分离、鉴定出组织外泌体。2.通过s RNA注释,发现mi RNA占s RNA的比例在肌肉外泌体和肝脏外泌体中分别约为1.36%和2.19%。在肌肉外泌体中鉴别到11个品种间差异mi RNA,其中novel-ssc-mi R-804-3p在大白猪中表达上调,它的靶基因富集到Notch、醛固酮、生长激素等通路。在肝脏外泌体中鉴别到8个品种间差异mi RNA,其中ssc-mi R-218在野猪中表达上调,它的靶基因富集到糖代谢、脂肪酸合成与分解等通路。3.鉴别到组织间的差异外泌体mi RNA总共224个,其中133个在肝脏中表达上调,91个在肌肉中表达上调。肝中上调的前10个差异mi RNA的靶基因富集到癌症、神经发育和感染相关通路,而肌中上调的前10个差异mi RNA的靶基因富集到细胞增殖分化相关通路。值得一提的是,我们在肝脏外泌体中检测到肝脏特异性表达的mi RNA(ssc-mi R-122-5p和ssc-mi R122-3p),在肌肉外泌体中检测到肌肉特异性表达的mi RNA(ssc-mi R-206、ssc-mi R-1、ssc-mi R-133a-3p和ssc-mi R-133b),表明本研究检测的外泌体RNA成分具有组织特异性。4.在肌肉外泌体中鉴别到猪品种间的差异编码基因(m RNA)总共387个。其中,在野猪中表达上调的有245个,它们富集到代谢调节和心脏疾病发生相关通路;另有142个在大白猪中表达上调,它们富集到调节免疫、病毒和细菌感染相关通路。此外,参与细菌粘附和单宁抗营养调节的b PRB2-like和b PRB4-like基因以及调控产热的UCP3基因在野猪中表达上调,而促生长基因IGF1和IGF2在大白猪中上调。5.在肌肉外泌体中鉴别到猪品种间差异lnc RNA总共28个,其中21个lnc RNA在野猪中表达上调,7个lnc RNA在大白猪中表达上调。野猪中上调lnc RNA的靶基因富集到糖和脂质代谢调节等通路,而大白猪中上调lnc RNA的靶基因富集到免疫和病毒感染相关通路。此外,可能与核糖体结构组成有关的lnc RNA BGIG9823_47711在野猪和大白猪中总表达量占比分别约为89.18%和95.02%6.对上述个体肌肉外泌体RNA表达谱与其它猪种(60日和200日龄)的肌肉组织RNA表达谱比较分析后,发现精子发生所必需的TEX14基因以及可能与公猪生育能力有关的ssc-mi R-10386均在肌肉外泌体中高丰度富集。本研究初步揭示了大白猪和野猪之间、肝脏和肌肉组织之间的外泌体RNA表达谱差异,从中发现一些可能参与调节猪品种生理机能差异或组织功能差异的RNA,同时还鉴别到一些外泌体中高度富集的RNA。这些结果为今后深入探究外泌体RNA对猪进化、表型形成和组织间通讯等方面的作用奠定基础,为家猪的遗传改良探索新的思路。
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