神经红蛋白(Neuroglobin，NGB)是近期由德国科学家Burmester,T.等在人和鼠脑中发现的一种新颖的珠蛋白类型，主要在脑和其它神经组织中表达。本文选择了几个氨基酸残基作为突变位点，设计了F28Y,F106Y，Y88F和V68S四个突变体蛋白，目的是想引入能够改变血红素周围疏水腔的极性和疏水环境的残基，因为它们可能对蛋白质的稳定性和折叠方式比较重要，可能与NGB发挥其生物功能密切相关。 本文采用PCR介导的定点突变方法对重组人神经红蛋白的基因进行改造，得到了目标突变基因，DNA序列分析结果验证了突变的正确性。 电喷雾质谱测得的蛋白质分子量与理论值吻合，从而验证了突变蛋白的正确性。紫外可见光谱、荧光光谱和圆二色光谱研究表明，定点突变使得蛋白的荧光基团更加暴露于极性环境，并影响了其二级结构的相对含量，这在突变体F28Y中表现的最为显著。但这并没有明显地改变蛋白质中血红素铁的配位环境，与野生型NGB一样，在没有外源配体存在的情况下，F28Y，V68S，Y88F和F106Y突变体蛋白中血红素辅基铁离子在两种氧化态下都是双组氨酸六配位结构。 神经红蛋白及其突变体对酸的稳定性研究表明，它们在酸性溶液中不稳定，血红素可以脱离蛋白链；随着酸度的增加，其荧光基团更加暴露于极性环境，导致荧光强度的显著增加；酸的存在可以破坏神经红蛋白及其突变体的二级结构。但所有的这些变化并不彻底，这可能是由于酸致变性的强度并不能完全抵消蛋白分子中的某些化学键和次级键的稳定作用的缘故。神经红蛋白及其突变体在酸中的稳定性顺序为：NGB＞V68S＞Y88F＞F28Y＞F106Y。 尿素变性研究表明，神经红蛋白相当稳定，具有较强的抗尿素变性作用，即使尿素浓度达到9mol/L时，变性也不完全；无论从血红素解离、荧光基团的环境还是从二级结构上看，神经红蛋白及其突变体的稳定性顺序均为：NGB＞Y88F＞V68S＞F28Y＞F106Y。二硫键的破坏，降低了蛋白分子对尿素的稳定性，二硫键具有稳定蛋白分子结构的作用。NGB在尿素中的变性和复性过程具有相似的CD光谱，说明蛋白链的折叠和去折叠的路径基本相同，NGB在尿素中的变性过程是可逆的。尿素变性再折叠动力学表明，NGB的复性过程很快，而各突变体蛋白则相对缓慢，这在很大程度上还是归因于定点突变对蛋白分子稳定性的影响上。尿素诱导的神经红蛋白及其突变体去折叠的荧光相图表明它们在尿素中的变性符合“三态模型”，而非简单的“两态模型”。定点突变并没有明显影响NGB在尿素中的变性机理。 盐酸胍是一种很强的变性剂，NGB及其突变体在盐酸胍中的变性较为彻底，在较高盐酸胍浓度下，蛋白变性基本达到平衡。盐酸胍变性动力学表明，它们可在盐酸胍中迅速的变性，并且不容易复性。它们在盐酸胍中的稳定性顺序为：NGB＞Y88F＞V68S＞F28Y＞F106Y。NGB的盐酸胍变性是一个非常复杂的过程，它至少包括五种蛋白质的不同状态，定点突变不仅可以改变蛋白质的稳定性，还可以改变其变性中间过渡态，影响蛋白质的去折叠过程。二硫键在稳定蛋白结构上起着重要的作用，定点突变虽然降低了蛋白分子的稳定性，但对二硫键的影响很小。 定点突变影响了蛋白分子的稳定构象，对血红素铁原子的配位环境产生了微扰，使得各突变体的热稳定性降低。Val68和Tyr88距离血红素相对较远，对其轴向配体的影响较小，因此它们的稳定性相对野生型蛋白稍有降低，而Phe28和Phe106则距离血红素两轴向配体较近，对血红素的影响较大，稳定性下降较多。突变体F106Y最不稳定，这是由于Phe106与血红素间存在较强的疏水作用，Phe→Tyr的改变使Phe106与血红素间的作用力减弱，从而导致血红素在热变性条件下更容易从蛋白分子中脱离出来。神经红蛋白及其突变体的热稳定性顺序为：NGB＞Y88F＞V68S＞F28Y＞F106Y，它们三种不同存在形式的热稳定性顺序为：无二硫键形式＞高铁六配位形式＞CN-结合形式。由此可见，蛋白分子内二硫键的破坏增加了远端组氨酸残基的亲合性，在一定程度上增加了蛋白分子的稳定性；外源配体的存在，破坏了血红素铁的天然六配位结构，导致血红素容易解离使蛋白的热稳定性降低。因此，NGB分子内六配位的血红素结构是其具有高热稳定性的必要条件。 荧光光谱研究表明，神经红蛋白及其突变体的荧光强度均可被氯化铯、碘化钾和丙烯酰胺所猝灭，但猝灭程度不同。氯化铯不能有效地使色氨酸的荧光淬灭，碘化钾则可使色氨酸的荧光较强淬灭，而丙烯酰胺可使色氨酸荧光绝大部分淬灭。这说明，NGB分子中只有少部分色氨酸处于分子表面且被带正电荷的氨基酸所包围，而大部分色氨酸则埋藏于分子内部的疏水区中。荧光猝灭的Stern-Volmer猝灭常数研究表明，神经红蛋白及其突变体的荧光被氯化铯、碘化钾和丙烯酰胺所猝灭的过程都是动态的猝灭过程，猝灭剂分子与激发态蛋白分子之间发生了相互作用。不同波长差下神经红蛋白及其突变体的同步荧光研究表明，当△λ=20nm时，同步荧光发射峰是由酪氨酸残基贡献的，当△λ=80nm时，NGB及其突变体分子内的酪氨酸和色氨酸残基得以同时监测。神经红蛋白及其突变体在不同pH下的同步荧光光谱及与ANS结合后的荧光光谱的变化表明，在酸性条件下(pH＜4.0)，蛋白分子不稳定，血红素辅基脱离蛋白链，导致荧光强度的显著增加；pH在5.0～10.0范围内，神经红蛋白及其突变体能够稳定存在。当pH大于10.0时，神经红蛋白及其突变体进入其碱致变性态，但这种变性作用并不能使血红素基团脱离蛋白链，血红素对色氨酸的荧光猝灭作用仍未解除。 远紫外圆二色光谱研究表明，神经红蛋白的二级结构对其周围环境比较敏感，环境的改变将导致其二级结构的明显变化。浓度的增加，溶剂性质的改变，溶液的酸碱性和温度的升高均能导致NGB二级结构中α-螺旋含量不同程度的减少，使其稳定性降低。从近紫外和可见区的CD谱可以看出，NGB虽然与其它类型的血红素蛋白如血红蛋白和肌红蛋白具有某种程度的相似性，但它也具有自己的特点。另外，血红素周围芳香氨基酸的存在，使得蛋白分子的CD光谱的椭圆率值有所提高，并且这种偶合效应的大小与芳香氨基酸和血红素之间的距离成正比。血红素L和N带的相互增强作用，只发生在它们之间相偶合的情况下，而不会发生在Soret和可见吸收峰之间。 神经红蛋白及其突变体类似过氧化物酶的活性研究表明，改变NGB分子血红素轴向配体的配位环境，可以提高蛋白质的酶活性。相对更加开放的血红素结合环境将会促进血红素的催化反应活性。在高pH下以及较高温度下，蛋白质的酶活性显著提高，并且这种高酶活性状态具有相当的稳定性，有望在高pH值、高温等恶劣环境中得以应用。