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目的:缺血性脑血管病的发生是由于动脉血管栓塞或血栓形成,引起局部脑组织血流短暂或永久的减少或中断而导致的中枢神经系统疾病。脑缺血的临床治疗手段以溶栓治疗为主,而溶栓后的血供恢复,往往会造成脑组织的再灌注损伤,使组织损伤加重。脑缺血再灌注损伤的一个重要病理过程为小胶质细胞(Microglia,MG)的炎性激活,缺血后激活的小胶质细胞会分泌炎性因子,使神经细胞处于炎性介质的环境,损伤神经细胞。研究表明,缺血再灌注激活的小胶质细胞和转录因子NF-κB主导了炎性反应的整个过程,那么,寻找有效的NF-κB抑制药,并阐明其抗炎机制,对于改善脑缺血再灌注损伤的临床治疗手段以及新疗法的开发,无疑将具有重要的意义。青藤碱(sinomenine,sin)是一种来源于防已科植物青藤的根茎的具有抗炎作用的化合物,虽然有研究表明其具有直接改善脑缺血,减轻神经细胞损伤的作用,但是关于其能否对抗缺血再灌注引起的小胶质细胞炎性激活,并未有相关研究报道。在本研究中,我们首先使用小鼠脑胶质细胞(BV-2)来建立体外缺血再灌注模型,即细胞的氧糖剥夺复氧糖(Oxygen-Glucose Deprivation/Reperfusion,OGD/R)模型,在模型建立成功的基础上,给予青藤碱预处理细胞,随后通过细胞炎性指标观察青藤碱抗BV-2细胞炎性激活的作用。在此基础上,对青藤碱抗OGD/R诱导的BV-2细胞炎症激活作用机制及调控通路加以归纳和分析,并对调控机制进行多层次的验证,从而明确青藤碱的抗炎机制,为青藤碱的临床应用提供实验室依据。方法:1.青藤碱抗BV-2细胞OGD/R炎性激活的作用分析体外培养BV-2细胞,加入不同浓度的青藤碱,培养后24小时,以CCK-8法检测细胞活性,明确青藤碱的实验浓度。进行实验细胞分组,设正常组、溶媒对照组、青藤碱高剂量组(10OμM)、青藤碱中剂量组(50μM)、青藤碱低剂量组(25μM)。各组细胞以青藤碱预处理后,进行氧糖剥夺复氧糖(OGD/R)处理,复氧糖后24小时,收集细胞上清检测炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量检测;收集细胞,Real Time-PCR检测TNF-α、IL-1β和IL-6基因mRNA含量;Western blotting检测NF-κB两组亚基p50和p65的磷酸化以及IκBα蛋白表达。2.青藤碱抑制OGD/R后BV-2细胞NF-κB激活的机制研究BV-2细胞分组,设正常组、溶媒对照组、青藤碱高剂量组(10OμM)、青藤碱中剂量组(50μM)、青藤碱低剂量组(25μM),同时按照25μM、50μM、100μM的终浓度加入青藤碱,正常条件培养BV-2细胞24小时后,分别提取细胞总RNA和细胞总蛋白,Real time-PCR和Western blotting检测IκBα mRNA和蛋白含量。通过生物信息学预测mmu-miR-183-5p在IκBα基因3’UTR的理论结合位点,再以293工具细胞转染miR-183-5p-mimics,miR-183-5p-inhibitor,空载质粒,野生型IκBα报告基因载体和突变型IκBα报告基因载体,48小时后进行荧光素酶检测。随后进行miR-183-5p启动子与转录因子SP1结合位点分析,构建小鼠SP1基因shRNA重组表达载体以及小鼠SP1基因cDNA表达载体,以及野生型和突变型miR-183-5p质粒表达载体,随后转染293工具细胞,靶向沉默和过表达SP1,以荧光素酶报告基因法验证SP1的转录活性。为了验证SP1/miR-183-5p/IκBα调控通路,我们通过慢病毒途径在BV-2细胞中转染SP1和miR-183-5p-mimics,接种转染后24小时的BV-2细胞至6孔培养板,后加入终浓度为100μM的青藤碱预处理,正常条件过夜培养,行OGD/R处理。细胞分为6组,正常组,模型组(OGD/R),青藤碱+模型组,pcDNA vector转染+青藤碱+模型组,pcDNA-SP1转染+青藤碱+模型组,miR-183-5p-mimics转染+青藤碱+模型组。并于复氧后24小时收集细胞,进行SP1、IκBα以及磷酸化的P50和P65检测。结果:1.CCK-8检测数据显示,与BV-2细胞共培养24小时后,2000μM青藤碱处理组细胞增殖活性明显低于对照组(P<0.01),青藤碱浓度5μM,25μM,50μM,100μM组的细胞活力与正常组无明显差异。因此将青藤碱的药物干预浓度定为25μM,50μM,100μM。炎性因子含量ELISA检测数据表明,与对照组比较,OGD/R模型组细胞上清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6相对含量明显增强(P<0.01),这说明OGD/R后BV-2细胞炎性激活。与模型组比较,青藤碱预处理组细胞上清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6相对含量均明显降低,其中100μM青藤碱预处理组细胞上清中TNF-α、IL-1β含量均明显低于模型组(P<0.01),数据表明,青藤碱预处理后再造模组细胞内炎性因子降低程度与青藤碱使用剂量呈明显梯度依赖。OGD/R处理能够明显增加BV-2细胞内炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6基因mRNA相对含量,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.01),青藤碱预处理+OGD/R处理组与OGD/R处理组比较,TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA含量均有所降低,其中TNF-α、IL-1β降低明显(P<0.01)。与对照组比较,OGD/R模型组细胞中p50和p65亚基磷酸化均明显增强,IκBα表达则尽显减弱(P<0.01),与模型组比较,青藤碱预处理组细胞中p50和p65亚基磷酸化程度均明显降低,IκBα表达却明显增强,且青藤碱预处理抑制p50和p65磷酸化和促进IκBα表达的作用呈明显梯度依赖(P<0.01)。2.给予BV-2细胞不同剂量的青藤碱处理24小时后,进行IκBα基因mRNA含量和IκBα蛋白表达检测。结果表明,青藤碱处理后各组细胞IκBα mRNA含量无明显差异(P>0.05),而青藤碱处理组IκκBα蛋白表达明显增强(P<0.01)。荧光素酶报告基因检测表明,miR-183-5p-mimic显著抑制野生型IκBα mRNA的3’-UTR报告基因载体的萤光素酶活性,miR-183-5p-inhibitor可以增强野生型IκBα mRNA3’-UTR报告基因载体的萤光素酶表达活性。而共转染miR-183-5p-NC的细胞对携带有野生型和突变型IκBα mRNA3’-UTR报告基因载体的萤光素酶表达活性无影响。对转录因子SP1与miR-183-5p启动子结合位点验证,结果表明,SP1过表达可以明显增强野生型miR-183-5p启动子报告基因表达载体转染细胞后的荧光素酶活性(P<0.01),对突变型miR-183-5p启动子报告基因表达载体转染细胞后的荧光素酶活性则无明显影响(P>0.05)。通过慢病毒途径在BV-2细胞中分别表达SP1,miR-183-5p-mimics,随后检测细胞SP1、IκBα以及p50和p65的磷酸化,分析青藤碱在抗缺血再灌注中的作用。结果表明与正常对照组比较,OGD/R模型组细胞SP1蛋白表达明显增强,IκBα含量明显降低,p50和p65磷酸化则明显增强(P<0.01)。100μM的青藤碱预处理能够明显抑制模型组细胞SP1蛋白表达和p50、p65的磷酸化,促进IκBα蛋白的表达(P<0.01)。SP1基因过表达能够明显增强细胞内SP1蛋白表达(P<0.01),miR-183-5p-mimics过表达对细胞内的SP1无显著影响(P>0.05)。SP1、miR-183-5p-mimics过表达均能明显导致细胞内IκBα蛋白表达降低(P<0.01),并且使p50、p65磷酸化增强(P<0.01)。结论:本研究首先使用小鼠脑小胶质细胞(BV-2)建立一个体外缺血再灌注模型,即细胞的氧糖剥夺复氧糖(OGD/R)模型,在模型成功建立的基础之上,给予细胞青藤碱预处理再造模,后通过细胞炎性指标观察明确青藤碱抗BV-2细胞的炎性激活的作用,在此基础上,我们对青藤碱抑制OGD/R诱导的BV-2细胞炎症激活的作用机制及调控通路加以归纳,并对调控通路进行多层次验证。初步得出以下结论:1.青藤碱可以有效抑制OGD/R诱导的BV-2细胞炎症,降低BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平,抑制p50和p65磷酸化,促进IKBα蛋白表达。2.青藤碱通过促进IκBα蛋白表达,进而抑制NF-κB活性,发挥抗炎作用,青藤碱在转录后水平调控IκBα蛋白的表达。3.mmu-miR-183-5p可以与IκBα mRNA 3’-UTR结合,从而在转录后水平抑制IκBα基因表达。4.转录因子SP1可以通过与mmu-miR-183-5p启动子结合,对其基因转录进行正调控。5.青藤碱抑制OGD/R诱导的BV-2炎性激活,主要通过SPl/miR183-5p/IκBα途径,即青藤碱通过抑制SP1蛋白表达,继而抑制miR-183-5p基因转录,miR-183-5p含量的降低,直接导致其靶蛋白IκBα表达增强,而IκBα表达增强可以使p50和p65磷酸化受限,NF-κB激活被抑制。