论文部分内容阅读
狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus, RV）感染引起的侵害中枢神经系统的人兽共患病，一旦发病，致死率几乎为100%。目前疫苗接种是预防狂犬病的主要措施之一。狂犬病病毒aG株是我国狂犬病人用疫苗毒株，其病毒全基因组序列尚未报道，因此该病毒的基因组结构、基因组组成特点、病毒与其它毒株之间的亲缘关系远近关系等尚不清楚。本研究选择aG毒株作为研究对象，在对其进行了全基因组序列的测定以及特征分析的基础上，完成了病毒全长cDNA以及构成病毒核糖核蛋白复合物的3个辅助质粒构建，通过共转染BHK-21细胞建立了该毒株的反向遗传学操作系统，主要研究成果如下：1．首次对狂犬病病毒aG毒株全基因组序列进行了测定，并将其基因组序列与Genbank中收录的其它狂犬病病病毒疫苗株进行了比对分析，其结果显示，aG株全长为11925nt，基因组包含5个完整的开放阅读框，分别编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）以及转录大蛋白（L）。基因组3′端前导序列和5′末端序列长度分别为58bp和70bp。基因间隔区长度分别为2bp、5bp、5bp以及24bp，基因组两端的11个碱基完全互补，这一区域可能在病毒生命周期有重要作用。2.首次对狂犬病病毒CVS-24毒株进行了全基因组测序，结果显示该毒株全长11927nt，基因组包含5个开放阅读框，分别编码分别编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）以及转录大蛋白（L）。基因组3′端前导序列和5′末端序列长度分别为58bp和70bp。该病毒基因组组成与别的狂犬病病毒株具有很高的相似性。3.根据已测定的狂犬病病毒aG株全基因组序列设计引物，扩增了覆盖整个基因组的3个片段并按照预先制定的顺序依次克隆入PCI哺乳动物表达载体。由于病毒基因组两个末端的序列在病毒转录和复制中有非常重要的作用，设计引物的同时在基因组5′和3′末端分别添加了具有自我剪切功能的拳头状核酶（HamRz）和丁肝病毒核酶（HdvRz）序列，经过测序验证HamRz和HdvRz成功的构建在病毒基因组的两端，因此载体可以获得精确的5′和3′末端aG毒株全基因组cDNA。根据N基因、P基因以及L基因的序列设计了扩增3个基因的引物，经过测序和酶切验证，构建了表达核蛋白、磷蛋白和转录大蛋白的辅助质粒pCINEO-N、pCINEO-P、pCINEO-L，为病毒拯救奠定了基础。4．将表达核蛋白、磷蛋白以及转录大蛋白的辅助质粒表达载体pCINEO-N、pCINEO-P、pCINEO-L与编码病毒全长cDNA的质粒按照一定比例共转染BHK-21细胞，5天后收获转染的细胞，然后将细胞反复冻融3次，经离心后取上清用于病毒RNA的提取，通过RT-PCR可以扩增出预期片段。5.将拯救成功的病毒上清液做10倍倍比稀释，用10-1到10-8的病毒分别通过脑内接种Balb/c小鼠，连续观察15d，记录小鼠死亡时间，根据结果计算LD50。重组病毒毒力可达6.2LogLD50。结果表明：本研究建立的反向遗传学操作系统成功拯救狂犬病病毒aG毒株。为本实验室研究病毒RV分子致病机制以及基于RV表达外源蛋白的载体建立了良好的技术平台。