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目的探究CML调控基质小泡释放从而介导糖尿病斑块内钙化的具体机制。方法(1)第一部分选取2017年至2020年在江苏大学附属医院心内科住院的患者71例,根据纳入标准和排除标准将患者分为糖尿病组(A组),糖尿病动脉粥样硬化组(B组),糖尿病斑块内钙化组(C组)。采集三组患者的血清学样本,通过差速离心法分离血清中基质小泡(MVs),进行酶联免疫吸附测定(ELISA)及统计学分析。(2)第二部分6周龄雄性ApoE-/-小鼠适应环境1周,予40mg/kg/day链脲佐菌素腹腔注射,连续5天。2周后血糖水平超过300mg/dL的ApoE-/-小鼠入组。将糖尿病ApoE-/-小鼠随机分为三组:对照组(普食,n=8)、高脂组(高脂饮食,n=8)、CML组(高脂饮食+尾静脉注射CML,n=8),连续饲养32周后对小鼠进行安乐死,选取主动脉组织进行形态学染色(HE染色、油红O染色、免疫荧光染色、Von Kossa染色)及分子生物学检测。(3)第三部分将小鼠主动脉平滑肌细胞(ASMCs)分为三组:对照组、ox-LDL组、CML组。所有细胞经过4天钙化诱导,提取MVs进行纳米颗粒跟踪分析(NTA)检测。构建糖尿病ApoE-/-小鼠模型,将CML组ASMCs分泌的MVs通过尾静脉注射进小鼠体内,随机分为对照组、CML组、低浓度MVs组、中浓度MVs组、高浓度MVs组,连续饲养16周后,进行Von Kossa染色及钙含量检测。在细胞水平上做相同处理,进行茜素红染色。(4)第四部分将ASMCs分为七组:NC MVs组,ox-LDL MVs组,ox-LDL MVs+IgG组,ox-LDL MVs+Anti-Sortilin组,CML MVs组,CML MVs+IgG组,CML MVs+Anti-Sortilin组,4天钙化诱导后对细胞进行Western blot检测和Von Kossa染色。结果(1)ELISA结果显示,与A组和B组相比,C组患者血清中CML、MVs中CD9和Sortilin的浓度明显增加,Pearson相关分析显示MVs中CD9和血清CML的浓度成正相关,同时MVs中Sortilin与CD9的浓度成正相关。(2)大体灌注、油红染色和Von Kossa染色显示,与对照组和高脂组相比,CML能明显促进糖尿病ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化以及斑块内钙化的形成。(3)免疫荧光染色和Western blot检测结果显示,与对照组和高脂组相比,CML组的Sortilin和CD9浓度明显增加。(4)NTA检测结果显示,与对照组和ox-LDL组相比,CML组平滑肌细胞分泌MVs的数量明显增加。平滑肌细胞和小鼠钙化程度随CML组MVs浓度的增加而加重。(5)ELISA检测结果显示,CML能够增加MVs中Sortilin的浓度。(6)Western blot和Von Kossa结果显示,CML组MVs较ox-LDL组MVs更能促进细胞钙化,而Anti-Sortilin能减少钙化相关蛋白的表达,减轻细胞钙化程度。结论(1)CML刺激平滑肌细胞释放的MVs能够加速糖尿病斑块内钙化的演进。(2)CML调控下MVs对钙化的促进作用可能是通过Sortilin实现的。