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目的:酒精性脂肪肝病(Alcoholic fatty liver disease,AFLD)是由于长期饮酒过量导致甘油三酯、磷脂、胆固醇在肝脏蓄积,引起肝细胞脂肪变性的疾病。AFLD发病率呈逐年上升趋势,临床也期待更加有效的药物。中医学认为桑葚是补阴药,具有补肾益气,解酒毒等功效。现代药理学研究桑葚花青素(氯化矢车菊素)是桑葚的主要活性成分。但目前关于桑葚花青素(氯化矢车菊素)治疗AFLD的研究甚少,其治疗AFLD的确切机制也不清楚。本研究探讨氯化矢车菊素(Cyanidin chloride,CC)对乙醇诱导的AML-12肝细胞甘油三酯沉积的影响,并研究其可能的分子机制。方法:采用乙醇诱导的AML-12肝细胞内脂质沉积模型。将细胞分为对照组(1 μL/ml DMSO,无乙醇,无氯化矢车菊素),乙醇组(50mM乙醇),氯化矢车菊素组(剂量分别为1 μM,10μM,100μM),和乙醇+氯化矢车菊素组(50 mM乙醇+不同剂量的氯化矢车菊素)。药物干预24h后,酶法测定AML-12肝细胞内甘油三酯(Triglyceride,TG)的含量,油红O染色观察AML-12肝细胞内脂滴的沉积情况,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测AML-12肝细胞固醇调节元件结合蛋白1(Sterol regulatory element-binding protein-1,SREBP-1)、乙酰辅酶 A 羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)、硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 1(Stearoyl-CoA desaturase 1,SCD-1)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase,FASN)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα)和剪接因子 Slu7(Slu7)mRNA 的表达。免疫印迹法(Westen Blot)检测AML-12肝细胞Slu7的蛋白表达。另外,采用乙醇诱导的AML-12肝细胞内脂质沉积模型。将细胞分为siRNA对照组(50 nM siRNA对照品,无乙醇),乙醇组(50 mM乙醇),不同剂量siSlu7干扰组(剂量分别为10 nM,50 nM,100 nM siSlu7)和乙醇+不同剂量siSlu7干扰组(50 mM乙醇+剂量分别为10 nM,50nM,100 nM siSlu7)。qRT-PCR检测AML-12肝细胞Slu7mRNA的表达,酶法测定AML-12肝细胞内TG的含量。结果:(1)与对照组比较,乙醇组细胞内甘油三酯含量显著升高(P<0.01)。与乙醇组比较,1μM的氯化矢车菊素对乙醇诱导的AML-12肝细胞内甘油三酯含量影响明显(P<0.05),但是当浓度增加到1OμM和100μM时,氯化矢车菊素能更显著降低乙醇诱导的AML-12肝细胞内甘油三酯含量(P<0.01)。而且随着药物浓度的升高,细胞内甘油三酯含量明显下降(乙醇+100μM氯化矢车菊素组与乙醇+10μM氯化矢车菊素组比较,(P<0.01)。不同浓度(1μM,1OμM和1OOμM)的氯化矢车菊素对AML-12肝细胞内甘油三酯含量影响不明显(与对照组比较,P>0.05)。从药物剂量来看,10μM药物剂量即可以起到显著保护作用,因此,我们采用10μM氯化矢车菊素进行后续实验。(2)油红O染色结果显示与对照组比较,乙醇组细胞内脂滴数量显著增加。氯化矢车菊素对AML-12肝细胞内脂滴沉积影响不明显。但是,与乙醇组比较,10μM氯化矢车菊素使细胞内的脂滴数量显著减少。(3)qRT-PCR检测结果显示,与对照比较,乙醇组AML-12肝细胞内固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD-1)和脂肪酸合成酶(FASN)的表达水平升高,而氯化矢车菊素能显著下调乙醇诱导的AML-12 肝细胞内 SREBP-1、ACC、SCD-1 和 FASN mRNA 表达水平(P<0.05,与乙醇组比较)。此外,与对照比较,乙醇组AML-12肝细胞内PPARα表达水平明显降低(P<0.05),而氯化矢车菊素能显著上调AML-12肝细胞内PPARα表达水平(P<0.05),且氯化矢车菊素能显著上调乙醇降低的AML-12肝细胞内PPARα表达水平(P<0.05,与乙醇组比较)。(4)与对照组比较,乙醇组AML-12肝细胞内Slu7 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05),而氯化矢车菊素能显著下调乙醇诱导的AML-12肝细胞内Slu7 mRNA和蛋白表达水平(P<0.01,与乙醇组比较)。(5)与对照组比较,10nM siSlu7即可降低AML-12肝细胞Slu7 mRNA表达水平(P<0.01),但当浓度达到50nM和100nM时,可显著降低(60%左右)AML-12肝细胞Slu7 mRNA表达水平(P<0.01)。从剂量效应来看,50 nM剂量降低Slu7 mRNA表达效果最好,因此,我们采用50nM siSlu7进行后续实验。(6)与对照组比较,乙醇组细胞内甘油三酯含量显著升高(P<0.05)。siRNA干扰Slu7表达对AML-12肝细胞内甘油三酯含量影响不明显(P>0.05)。但有趣的是,与乙醇组比较,siRNA干扰Slu7后降低乙醇诱导后AML-12肝细胞内甘油三酯含量(P<0.01)。结论:氯化矢车菊素能够改善乙醇诱导的AML-12肝细胞甘油三酯沉积,可能与抑制剪接因子Slu7 mRNA和蛋白表达,从而抑制脂质合成相关基因SREBP-1、ACC、SCD-1和FASN mRNA的表达,激活脂质氧化相关基因PPARα mRNA的表达密切相关。本研究为阐明桑葚有效活性成分治疗AFLD的机制以及为治疗AFLD提供了新的、有前景的营养或治疗药物。