番茄青枯病拮抗微生物的构建及生防机理研究

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番茄(Solanum lycopersicum L.)原产南美洲,传入中国时是作为一种观赏植物,由于其含有丰富的胡萝卜素、维生素C和B族维生素、营养价值高,是全世界重要的经济作物。由青枯雷尔氏菌引起的番茄青枯病是番茄的主要土传病害之一,给全世界造成了巨大的经济损失,由于病原菌特殊的致病机制,目前的防治措施都不能从根本上抑制番茄青枯病的发生。因此,本研究旨在通过筛选和构建高效生防菌株来探究其生防效果及抑菌机制。为获得具有拮抗功能的土壤根际细菌,对发病田间健康番茄植株的根际土样本进行采集,初步筛选对病原青枯具有潜在生防能力的拮抗菌,并利用常温常压等离子(ARTP)诱变和基因组重排技术提高其抑菌能力,得到高效拮抗菌株。将构建的生防细菌与化学防治联用,从番茄的表型形状、生理特性方面来评价防治效果,利用微生物多样性和代谢组学探究芽孢杆菌对番茄青枯病的防治机制。主要研究结果如下:(1)基于微生物拮抗剂对防治植物病害具有重要应用价值和潜力的现状,以分离、筛选番茄根际微生物,挖掘对番茄青枯病进行生物防治的拮抗菌株,建立拮抗菌株筛选体系,为生防菌剂提供菌种资源。在此研究中,从121株番茄根际细菌采用平板对峙法初步分离筛选,得到了16株具有抑制青枯病原菌的拮抗细菌,后利用建立的根浸法复筛法在短期内快速评价拮抗菌对番茄青枯病的生防潜力,其中菌株WJB0802盆栽防效高达68.25%。经全基因组测序鉴定分析,WJB0802鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis,具有分泌多种抗菌物质的能力,产生多种拮抗细胞活性物质以及抑菌蛋白,从而实现对番茄青枯病防治。(2)为进一步提高WJB0802的抑菌能力获得优良菌株,采用基因组重排技术,构建了一株抑菌能力相较于出发菌株提高60%的突变菌株GSJB1210。首先利用ARTP诱变构建了正向突变菌株库,利用基因组重排技术将突变库菌株杂交融合,得到了8株抑菌效果提高的融合菌株,其中融合菌株GSJB-1210抑菌能力最为显著,其抑菌圈直径达36.0 mm。以出发菌株为参考基因,通过全基因组测序及重测序,发现GSJB-1210共有38211碱基发生了变异,通过预测代谢产物合成基因簇,发现该菌株有10类抗生素基因簇,且与生防能力有关的基因显著增加了200多个,其抑菌活性显著高于出发菌株。(3)为符合目前绿色农业发展理念,尽可能的减少化学药剂的使用,将高效拮抗菌株GSJB-1210与化学杀菌剂联合使用,研究其对番茄青枯病的防治作用。采用抑菌圈法测定6种杀菌剂对番茄青枯菌的毒力,并计算其EC50值。利用紫外分光光度法测定杀菌剂与GSJB-1210的相容性,筛选出最适杀菌剂并与菌株联用于盆栽试验,通过Horsfall法确定最优复配比。结果表明,宁南霉素的EC50为3.66 mg/L,与GSJB-1210菌株具有良好的生物相容性。宁南霉素(3.66mg/L)与GSJB-1210(10~8CFU/m L)体积比为4:6时,对番茄青枯病的防治效果达到77.02%,生防效果显著高于单剂。宁南霉素能与GSJB-1210联用防治番茄青枯病,且协同效应显著。(4)通过生防菌剂与化学杀菌剂的施用处理(F6:化学杀菌剂与生防菌剂联用,F0:杀菌剂处理组,F10:生防菌剂)显著影响了番茄根际细菌的群落组成及多样性。变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinomyces)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、髌骨菌门(Patescibacteria)、绿菌门(Chlorobacterium)和厚壁菌门(Firmicutes)等细菌门在所有土壤样本细菌群落中占主导地位。应用单一微生防菌剂GSJB-1210后,在门水平上,厚壁菌门和放线菌门的RA显著升高;在属水平上,芽孢杆菌和假单胞菌的RA均高于CK,与CK相比,F0处理组微生物丰度显著降低,对根际微生物群落丰度具有一定的负面影响,会导致根际微生物群落结构遭到破坏。宁南霉素与生防菌株GSJB-1210联合使用,降低了化学杀菌剂对微生物群落丰度的负面影响,在显著抑制细菌性青枯病的发生,使微生物群落处于更健康的状态。(5)基于代谢组学分析,揭示了微生物菌剂与化学杀菌剂联用处理对番茄根际代谢物组成的影响。代谢组分析中的KEGG富集结果显示,在三个处理组中共同显著富集的通路分别是ABC转运、苯丙类化合物的生物合成、苯丙烷生物合成。经菌剂、化学杀菌剂、生防菌剂与化学杀菌剂联用处理后均能显著改变番茄根际的代谢物组成;生防菌处理后所富集到的吲哚乙醛、色氨酸、阿魏酸、水杨酸甲酯、芥子酸、原儿茶酸、2-羟基肉桂酸、艾蒿素、氯原酸、竹桃霉素等具有抑菌活性的代谢物显著提高,这些显著差异的代谢物与富集到的通路均与植物抵抗病原体入侵的能力相关。
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