目的:脑胶质瘤是人类中枢神经系统最常见肿瘤,占颅内原发恶性肿瘤的77%-80%,严重影响着人类的健康。目前对胶质瘤主要采用手术加放化疗等综全性治疗,但并未能根治胶质瘤患者。自从1926年Bailey和Cushing首次提出胶质瘤的病理分类开始,几乎所有分类均为组织学分类,依据光镜下的病理分类并未能很好判断胶质瘤患者病情程度和预后结果。国际神经病理协会和癌症基金会2000年新的胶质瘤病理分类包括了大量临床和遗传学的统计数据,这种综合性的分类反映了这些年来人类对胶质瘤这一复杂疾病的新的认识,是现今临床和科研的重要依据。肿瘤的发生、发展和肿瘤发生的实验性逆转、复发都伴随着复杂的基因表达模式的改变,而生物芯片对研究这一现象提供了一种强有力的工具。生物芯片技术是近年来生命科学与微电子学相互交叉渗透发展起来的一门新技术。该技术能快速、准确、高通量分析核酸、蛋白质、细胞等样本数据,被广泛应用于肿瘤marker的寻找和研究中。表达谱芯片技术能在一次实验中完成对成千上万基因的检测,可以对一定生长时期、不同级别的肿瘤进行全面的分析,从而揭示许多新的、重要的肿瘤相关基因。2007年2月美国FDA批准了第一个基因诊断芯片:MammaPrint。该芯片可用来对各种乳腺癌患者进行基因分型和预后判断,诊断和对病人预后评估方面强于传统病理诊断。该芯片上的70个基因就是荷兰科学家MARC. J.等使用乳腺癌患者基因芯片和生物信息学方法确定下来的。这一令人鼓舞的研究成果为目前肿瘤的诊断分型、个性化治疗方法选择及病人预后估计方面指明了前进道路。但是,由于不同平台、不同芯片、不同样本,所以芯片分析的数据不尽相同,甚至有相悖的结论。因此,芯片数据的重复性和可靠性较差是芯片技术存在的问题之一。研究表明:如果比较相同探针在同一张芯片上不同的点,相关系数一般大于95%;如果同一样本,分成两份分别抽提RNA、标记、杂交和进行图像扫描,相关系数可能降到60%--80%;假如采用染料互换方案(dry-swap),就是Cy3和Cy5标记的样本和第一次刚好相反,相关系数值还可能下降;如果从样本采集开始就采取独立的实验,因为不同样本的生物学差异情况非常复杂,芯片结果会反映这种差异,所以芯片之间相关系数值可能会降到30%;如果芯片实验在不同实验室完成,相关系数可能会很低。因此,芯片实验需要有良好的实验设计和合理的统计学分析,尽量克服微矩阵芯片重复性较差的问题。该课题的研究目的是利用临床收集的150例左右胶质瘤标本,利用cDNA芯片和Affymetrix Oligo芯片对不同样本在不同平台进行胶质瘤特异性靶标筛选和分析,并对两组芯片筛选出的13条重要基因进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)验证,通过上述分析找到有进一步深入研究价值的诊断靶标和治疗靶点。本课题同时用Meta分析对两种芯片找到的数据进行整合分析,较好解决不同平台、不同芯片、不同样本,导致芯片分析的数据重复性和可靠性差的问题。最后,本课题还总结了应用基因芯片对胶质瘤进行研究的方法。方法:1、cDNA芯片脑胶质瘤数据分析该部分应用cDNA芯片技术建立38张胶质瘤基因表达谱,其中星形质瘤细胞瘤Ⅰ级1例;Ⅱ级7例;Ⅲ级5例;Ⅳ级20例,少枝胶质细胞瘤Ⅱ级4例;Ⅲ级1例。结合胶质瘤临床流行病学特点对其进行生物信息学分析,筛选在所有胶质瘤实验组和对照组一致上调或下调的差异表达基因;筛选星形胶质瘤、室管膜瘤、少枝胶质细胞瘤之间差异基因;筛选和增殖、凋亡和分化相关的基因;并关注目前研究中与胶质瘤发病和恶性变相关的热点基因或生物学指标的变化;针对筛选出的重点差异表达基因,对其生物学功能结合当前数据库和文献报道,以整体和网络的思想阐明其间相互作用关系,进而探讨胶质瘤发病和恶变的机制。2、Affymetrix Oligo芯片脑胶质瘤数据分析本部分使用Affymetrix Human U133 2.0基因表达谱芯片,该芯片含54000个探针集,45000个转录本、38500个已知功能基因对星形质瘤细胞瘤Ⅰ级2例;Ⅱ级5例;Ⅲ级5例;Ⅳ级5例,少枝胶质细胞瘤Ⅱ级5例;室管膜瘤Ⅱ级4例共26例胶质瘤进行表达谱分析。应用生物信息学及相应软件对数据进行Gene Ontology和Pathway分析;利用挖掘出的基因数据利用支持向量机法和贝叶斯混合协变量分析法对高、低级别胶质瘤进行判别检验;挖掘出的基因数据利用最近邻域分析法和最近质心法对三种不同类型胶质瘤进行判别检验;并用贝叶斯学习构建基因相互作用网络。3、对两组芯片筛选出的13条重要基因进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)验证4、对cDNA芯片和Oligo芯片脑胶质瘤表达谱数据Meta分析并总结应用基因芯片对胶质瘤进行研究的方法结果:1、筛选出的差异基因:(1)按不同标准筛选出不同类型胶质瘤及不同级别胶质瘤之间差异基因①、13例星形胶质瘤(A)、20例胶质母细胞瘤(G)、5例少枝胶质瘤(O)之间以p〈0.1为标准筛选出111条差异基因,功能涉及细胞周期、有丝分裂、细胞免疫等重要功能;②、低级别星胶(AI+AII)9例与高级别星胶(AIII+GBM)之间以p〈0.01为标准筛选出409条差异基因;③、A与G之间p〈0.005为标准筛选出145条差异基因;④、A与O之间p〈0.01为标准筛选出391条差异基因;⑤、G与O之间p〈0.005为标准筛选出452条差异基因,用以上差异基因进行非监督聚类,均能理想区分不同肿瘤,证实不同级别及类型胶质瘤间存在基因上的不同;(2)对AII 7例、AIII 5例、GBM 20例进行差异基因筛选:①、AII与AIII以p〈0.01筛选出78条差异基因;②、AIII与GBM以p〈0.005筛选出66条差异基因;低级别星胶(AI+AII)9例与高级别星胶(AIII+GBM)之间以p〈0.01为标准筛选出409条差异基因;③、AII与GBM以p〈0.001筛选出121条差异基因,聚类结果理想。2、依据cDNA胶质瘤表达谱芯片数据结合统计学方法建立判别方程,对胶质瘤样本进行预测和判断。胶质瘤在显微镜下病理诊断存在主观误差,鉴于胶质瘤基因表达谱的样本聚类结果提示其病理分类有分子生物学基础,本实验依据cDNA胶质瘤表达谱芯片数据结合统计学方法尝试建立判别方程,可以对胶质瘤样本较好的预测和判断。3、研究中所发现的差异表达的基因、重要染色体以及在胶质瘤发生发展中起重要作用通路在所有38例样本中,其中至少在27例(70%)胶质瘤中都有差异表达的基因677条。其中一致下调的基因有453个,一致上调的基因有224个。其中属于intracellular component、binding和metabolism组分的较多,其功能主要包括调节细胞增殖、细胞周期、及细胞分化等。对与胶质瘤相关的差异表达基因进行了染色体定位研究,发现胶质瘤的染色体变化多涉及1p,17p,13q,9p,19,10,22q,18q,和7,12q,和相关文献报道一致。在调控通路方面进行生物信息分析,发现如下通路在胶质瘤发生发展中起重要作用:cell cycle;cell differentiate- on ;apotosis ;immune respone ;DNA repair; cell proliferation。在对胶质瘤发生发展相关重点基因分析中发现有10条重要上调基因值得深入研究。4、星形胶质瘤中肿瘤标志物研究对33张星形胶质瘤芯片进行重点分析,目的找到能做为鉴别星形胶质瘤及不同恶性程度的肿瘤标志物,按在1/3星形胶质瘤中及1.5倍表达差异为标准,T检验、FDR双重统计学方法筛选出星形胶质瘤Ⅰ、Ⅱ级与Ⅲ、Ⅳ级间分型基因148条,上调34条,下调114条;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级与Ⅳ级星胶分型基因110条,上调28条,下调82条。为找到理想诊断靶和治疗靶做进一步深入研究,特别关注以下几条随星形胶质瘤级别增加而表达增加的上调基因。①COL1A2;②MAP3K7;③SGCE;④RB1;⑤CCL4;⑥SPP1;⑦ID3;⑧MTHFD1;⑨NPC2;⑩GMEB1。5、星形胶质瘤II级、少枝胶质瘤II级、室管膜瘤II级三种同一级别不同类型胶质瘤的分子标志物研究。所分析出的这些基因可较准确地区分和预测以上三类肿瘤。支持向量机法和贝叶斯混合协变量分析法能较好对高、低级别胶质瘤进行判别检验,准确率在85%以上;挖掘出的基因数据利用最近邻域分析法和最近质心法对三种不同类型胶质瘤进行判别检验的准确率不到70%;并用贝叶斯学习构建基因相互作用网络,能较好说明10条重要基因相互之间作用关系。6、VEGF、SOD2、COL1A2、MAP3K7、CDC2、SPP1 6条基因经RT-PCR验证,与星形胶质瘤病理级别呈正向依赖关系。结论:1、基因芯片技术在后基因组时代在胶质瘤研究中仍发挥重要作用;2、不同平台、不同芯片、不同样本,芯片分析的数据不尽相同,而Meta分析能较好解决芯片数据的重复性和可靠性差的问题;3、生物信息学能很好对芯片数据进行挖掘和分析;4、VEGF、SOD2、COL1A2、MAP3K7、CDC2、SPP1等6条基因与星形胶质瘤关系密切,可作为诊断靶标和治疗靶点进行深入研究。