目的：利用RGD 肽能特异性识别并结合肿瘤细胞表面整合素的特性，构建含RGD肽的IL-24 突变体(RGD-IL-24)，使得IL-24 能靶向作用于肿瘤细胞。与IL-24 对照，研究RGD-IL-24 对4 种肿瘤细胞A549、HepG-2、HeLa、ACHN 及正常细胞NHLF 的生长抑制作用并初步探讨其作用机制，为进一步研究RGD-IL-24 的体内靶向抑瘤活性及其临床应用奠定基础。同时丰富了IL-24 在肿瘤治疗中的应用形式，为肿瘤靶向治疗提供了新思路。　　 方法：　　 1. 利用定点突变技术，在IL-24 的cDNA 序列中插入了甘氨酸密码子GGC，使表达IL-24 蛋白的Arg-164 和Asp-165 残基之间中插入Gly 残基，从而构建含RGD 肽模体的IL-24 突变体(RGD-IL-24)；将此重组的cDNA 插入表达质粒pET28a(+)，获得重组质粒pET28a/RGD-IL-24，通过酶切、测序鉴定阳性重组质粒。　　 2. 利用重组质粒转化菌株BL21(DE3) 进行蛋白表达，SDS-PAGE 电泳和Western Blotting 鉴定，确定目的蛋白的表达。通过重组工程菌的诱导培养，获得RGD-IL-24 包涵体。洗涤溶解后利用目的蛋白携带的6×His 纯化标签，采用镍离子亲合层析纯化蛋白RGD-IL-24。通过透析复性使目的蛋白正确折叠。　　 3. 检测RGD-IL-24 抗肿瘤活性，用RGD-IL-24 体外治疗人肺癌细胞株A549、子宫颈癌细胞株HeLa、肝癌细胞株HepG2、肾癌细胞株ACHN 和正常人肺成纤维细胞株NHLF， MTT 检测细胞的体外增殖；FITC-annexin V 染色检测细胞早期凋亡；DAPI 染色检测细胞晚期凋亡；western blot 检测bax、bcl2 蛋白的表达和caspase3 的活化情况。　　 4. RGD-IL-24 的免疫活性测定，应用双抗体夹心ELISA 法检测RGD-IL-24刺激外周血单核细胞(PBMC)产生IL-6、TNF-α和INF-γ的能力。　　 5. 细胞粘附实验和粘附抑制实验检测RGD-IL-24 在体外与肿瘤细胞的结合特性，鉴定RGD-IL-24 体外对肿瘤细胞的靶向特性。　　 结果：　　 1. 成功构建了RGD-IL-24 的基因，并插入表达质粒pET28a(+)，构建了重组质粒pET28a/RGD-IL-24，DNA 测序结果显示，重组质粒序列与理论序列完全吻合。　　 2. 重组质粒pET28a/RGD-IL-24 转化表达菌株后，经诱导培养，收获菌体总蛋白，SDS-PAGE 电泳并考马斯亮蓝染色后，分析表达目的蛋白RGD-IL-24 约占菌体总蛋白的30.47％，且目的蛋白的表达形式主要为包涵体。洗涤溶解后采用镍离子亲合层析得到纯度为90％以上的RGD-IL-24 蛋白。复性的RGD-IL-24 蛋白冷冻抽干后保存。　　 3. MTT 检测细胞的体外增殖实验证实，RGD-IL-24 和IL-24 治疗后的肿瘤细胞A549、HepG-2、HeLa 和ACHN 增殖明显被抑制，均与对照组增殖状况有显著性差异(均P<0.01)，但对正常细胞NHLF 无影响。进一步分析发现RGD-IL-24 抑制肿瘤增殖的效果比IL-24 显著增强(P<0.05)。　　 4. FITC-annexin V 和DAPI 染色检测细胞凋亡结果显示，RGD-IL-24 和IL-24 治疗后的肿瘤细胞A549、HepG-2、HeLa 和ACHN 凋亡明显，均与对照组有显著性差异(均P<0.01)，但正常细胞NHLF 无凋亡。进一步分析发现RGD-IL-24 诱导肿瘤细胞凋亡的效果比IL-24 显著增强(P<0.05)。　　 5. western blot 检测Bax 和Bcl2 蛋白表达及caspase-3 的活化情况，RGD-IL-24 和IL-24 治疗48 小时后，4 种肿瘤细胞A549、HepG-2、HeLa 和ACHN 中bax/bcl2 的比值是增加的，RGD-IL-24 组增加较高。同样，RGD-IL-24和IL-24 治疗48 小时后，肿瘤细胞中检测到活化的caspase-3，且RGD-IL-24组caspase3 活化较多。　　 6. 用RGD-IL-24 蛋白诱导人PBMC 产生IL-6、TNF-α和INF-γ的能力为指标，测定RGD-IL-24 突变蛋白的免疫刺激活性，结果显示，RGD-IL-24 诱导人PBMC 产生IL-6、TNF-α和INF-γ的能力比IL-24 显著提高(P<0.05)。　　 7. 细胞粘附实验和粘附抑制实验表明，RGD-IL-24 通过RGD 肽靶向性的与肿瘤细胞整合素αvβ3 结合，能够特异性地作用于肿瘤细胞。　　 结论：　　 1. 成功构建IL-24 突变体RGD-IL-24，并在大肠杆菌高效表达重组蛋白RGD-IL-24，且建立了RGD-IL-24 的纯化和复性工艺。　　 2. RGD-IL-24 蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长的能力。同时通过RGD 肽能够特异性结合肿瘤细胞，具有肿瘤靶向性，显著提高IL-24 的抗肿瘤活性。