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单酯和二酯脂肪酶是一类具有独特底物选择性的脂肪酶,它们只能分解甘油单酯和甘油二酯,而不能水解甘油三酯。SMG1是一种来自于球形马拉色菌的胞外脂肪酶,与人的脂溢性皮炎、毛囊炎、花斑癣、头皮屑等多种皮肤疾病密切相关,因此,脂肪酶SMG1可以作为这些皮肤疾病治疗药物筛选的潜在靶点。同时,SMG1是一种单酯和二酯脂肪酶,特别适合用于高纯度甘油二酯的酶法制备,所以,脂肪酶SMG1又极具工业应用价值。本课题对单酯和二酯脂肪酶SMG1的酶学性质进行了深入研究,并解析了它的晶体结构,为脂肪酶SMG1进一步工业化应用的分子改造和抗马拉色菌药物的设计提供了借鉴和指导。具体研究内容和主要结果如下:(1)球形马拉色菌单酯和二酯脂肪酶SMG1的克隆和表达。从Genbank数据库中获得的球形马拉色菌单酯和二酯脂肪酶SMG1基因序列(Genbank ID: XP001732204.1.)存在长度为57bp的信号肽序列。在完成毕赤酵母密码子优化之后,将编码成熟肽的基因拆分为了18条引物,通过两步重叠PCR法合成了脂肪酶SMG1的基因序列。将构建的表达载体pGAPZαA-smg1转化到毕赤酵母中,并实现了重组单酯和二酯脂肪酶SMG1在毕赤酵母中的高效表达。(2)球形马拉色菌单酯和二酯脂肪酶SMG1的纯化和酶学性质研究重组单酯和二酯脂肪酶SMG1被分泌到毕赤酵母胞外,而毕赤酵母本身分泌的背景蛋白质极少,因此重组脂肪酶SMG1经过阴离子交换柱一步纯化之后,其纯度满足酶学性质研究的要求。实验表明,单酯和二酯脂肪酶SMG1适于常温使用,其最适催化温度为25℃,当温度超过40℃后,脂肪酶SMG1会迅速地变性失活。脂肪酶SMG1的最适反应pH为6.0左右,同时实验表明,脂肪酶SMG1在偏碱性环境下保存会更加稳定。使用不同碳链长度的对硝基苯酚酯作为底物来检验脂肪酶SMG1的脂肪酸特异性发现,脂肪酶SMG1对于短链长和中链长的对硝基苯酚酯水解能力差异不大。检测了不同的金属离子在5mM浓度下对于脂肪酶SMG1酶活的影响,发现仅Mg2+和Mn2+对于脂肪酶SMG1有极其微弱的激活效果,其它金属离子则表现出显著的抑制作用。在用甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮四种常用的有机溶剂处理之后,脂肪酶SMG1的酶活有不同程度的显著提高。“界面激活”是脂肪酶一个典型的催化特性,但是在脂肪酶SMG1的界面催化反应中并未观察到脂肪酶SMG1对于聚集状态的底物的水解能力会出现急剧的提高。四类不同表面活性剂对于脂肪酶SMG1酶活影响的实验显示,脂肪酶SMG1对于表面活性极为敏感,表面活性剂容易使其变性失活:非离子型表面活性剂Triton X-100和阴离子型N-月桂酰肌氨酸钠只在极低的浓度条件下对于脂肪酶SMG1有微弱的活化效果,但稍微增大浓度就会表现出强烈的抑制作用;而兼性离子型表面活性剂3-磺丙基十四烷基二甲甜菜碱和阳离子型表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵对脂肪酶SMG1只表现出了强烈的抑制效果。(3)球形马拉色菌单酯和二酯脂肪酶SMG1的晶体学研究采用凝胶排阻层析进一步纯化重组脂肪酶SMG1,以满足蛋白质结晶研究的纯度要求。通过预结晶实验确定了筛选脂肪酶SMG1晶体生长的适合蛋白质浓度为10mg/mL左右。经过结晶条件初筛和优化,我们在0.1M Bis-Tris pH6.5,20%PEGMME5000和10%PEG1000,10%PEG8000条件下获得了2个具有较高衍射质量的晶体。这两个晶体是通过分子置换的方法完成了结构解析。单酯和二酯脂肪酶SMG1的两个晶体结构分别为3UUE和3UUF,它们的分辨率分别为1.45和2.60。脂肪酶SMG1呈现典型的α/β水解酶折叠(α/β hydrolase fold)结构,由8片β折叠片和连接这些β折叠片的α螺旋组成。脂肪酶SMG1的催化三联体是由Ser171,Asp228和His281三个氨基酸组成,它们在空间上的排布极为保守。脂肪酶SMG1的“氧负离子洞”是由Thr101和Leu172两个氨基酸主链的NH构成,可以稳定底物反应过程中形成的中间体四面体,具有降低过渡态的活化能作用。脂肪酶SMG1与同源脂肪酶在结构上的最大区别在于,在脂肪酶SMG1的“盖子”区域并未包含常见的两亲性α螺旋,只是一段呈现为无规则卷曲的loop。脂肪酶SMG1这种独特结构使得“盖子”移动所受限制更少;同时“盖子”与催化口袋的结合作用力相对很弱,使得脂肪酶SMG1可以在不存在“油水”界面的体系中,顺利得将其“盖子”打开。(4)单酯和二酯脂肪酶SMG1的底物选择性研究由于脂肪酶SMG1的两个晶体结构都是处于“盖子”闭合的构象,脂肪酶SMG1的催化中心被其“盖子”区域所占据。为此,我们通过同源建模和结构融合的方法构建了脂肪酶SMG1的开放的结构,用于研究底物和脂肪酶SMG1之间的相互作用。脂肪酶SMG1-底物类似物的复合结构经过分子动力学优化后,发现位于“盖子”N端的Leu103和催化组氨酸附近的Phe278的侧链伸向催化口袋内部,将脂肪酶SMG1的催化口袋分割成两个小口袋,分别用来容纳甘油二酯的两条酸链,没有多余的空间来容纳额外的第三条羧酸链,因此,单酯和二酯脂肪酶SMG1只能水解甘油二酯和甘油单酯,而无法水解甘油三酯。