莱氏野村菌(Nomuraea rileyi= Metarhizium rileyi)是全世界广泛分布的环境友好型生物防治真菌，主要侵染夜蛾科的害虫。其分生孢子是真菌杀虫剂的有效成分，但分生孢子在常规的真菌培养基上产孢量低、且需要光照等因素限制了该菌的规模化生产和商业化应用。本实验室通过液体发酵成功诱导出莱氏野村菌微菌核（王中康，2012，ZL2011103033145），微菌核（microsclerotium，MS）是在特定条件下由菌丝的大量聚集缠绕特化形成的一种休眠繁殖体结构，其作为害虫生防接种体，萌发生长过程快、抗逆性强、货架期长、稳定性高等优良特性，为新的莱氏野村菌杀虫制剂的创制提供了全新的来源。前期实验室工作已经证实，微菌核的形成是一种氧化胁迫的过程，微菌核的形成伴随着色素的沉淀、活性氧（ROS）的大量产生以及大量氧化胁迫相关基因的上调表达，对这一调控通路的研究可为开发高毒力的莱氏野村菌生防制剂提供重要的理论依据。本实验从已建立的 N.rileyi转录组文库中筛选出与微菌核诱导形成相关的两个上调表达的Cu/Zn-sod基因，分别命名为Nrsod1和Nrsod2，并通过基因敲除的方法，探索Nrsod1、Nrsod2基因功能，主要研究结果如下：　　①莱氏野村菌sod基因的克隆与鉴定　　克隆得到Nrsod1基因ORF全长564bp，编码187个氨基酸，含有一个内含子（75bp）；Nrsod2基因ORF全长915bp，编码304个氨基酸，没有内含子。通过同源性比对以及构建进化树进行系统发育分析，结果显示：两个基因编码的氨基酸序列与绿僵菌属的sod序列同源性较高，同源性在92％以上，其氨基酸序列中共同具有sod超家族序列保守功能区。　　②缺失突变转化子筛选与验证　　利用FPNI-PCR的方法扩增得到Nrsod1、Nrsod2基因的全长序列以及5端和3端侧翼序列，将侧翼序列重组到Pzp-Ptrpc-Hph-Knock载体上，构建敲除载体Pzp-hph-Nrsod1、Pzp-hph-Nrsod2。转入农杆菌，利用莱氏野村菌芽生孢子作为受体细胞与农杆菌共培养，以潮霉素抗性作为筛选标记，通过PCR验证转化子，并通过测序分析证明，成功获得2个基因的缺失突变转化子，命名为△Nrsod1、△Nrsod2。　　③缺失突变体表型分析　　缺失突变体表型分析结果表明：与野生型相比，△Nrsod1和△Nrsod2酵母态向菌丝态转化的时间推迟1.5d；对菌落生长速率、产孢量和萌发率测定后发现，△Nrsod1和△Nrsod2产孢量分别下降21%和54%；突变体分生孢子萌发率和菌丝生长速率与野生型相比并不显著。抗逆性分析显示：在盐胁迫、刚果红胁迫、氧胁迫条件下，基因缺失菌株均各自显示出不同程度的生长缺陷，其中△Nrsod2缺陷更为明显，其中甲萘醌完全抑制其生长；两个sod基因缺失均未影响分生孢子对高低温胁迫的耐受力；紫外辐射处理下突变体分生孢子萌发率与野生型相比显著降低，说明sod缺失使得孢子对 UV-B敏感性提高。对莱氏野村菌微菌核形成影响分析发现：△Nrsod1和△Nrsod2突变菌株微菌核生物量分别降低34.6%和51.5%；微菌核数量分别降低45%和72.5%；显微观察发现，△Nrsod1和△Nrsod2微菌核形成延迟，菌核减小，其中△Nrsod2菌核形态不规则。　　④sod基因表达模式分析　　莱氏野村菌sod基因表达模式分析表明：Nrsod1和Nrsod2在3d（微菌核形成期）均上调表达，表明Nrsod1和Nrsod2均参与微菌核的发育形成过程；而Nrsod2在5d（微菌核成熟期）再次上调表达，说明Nrsod2参与了微菌核形成以及成熟的整个过程。对突变体中Nrsod1和Nrsod2的定量检测研究发现：当Nrsod1基因缺失时，Nrsod2基因表达量显著降低，当Nrsod2基因缺失时，Nrsod1基因表达量显著降低；Nrsod1和 Nrsod2基因的缺失，不会刺激对方基因发生补偿性转录激活，而是一个基因的缺失抑制另一个基因的表达。对sod基因上下游相关基因定量分析显示：Nrsod1和Nrsod2在微菌核形成中不仅仅自身发挥重要作用，也通过调控NOX复合体和CAT家族有关基因的活性进而影响MS的形成。　　⑤sod突变体毒力测定　　对sod突变体毒力测定结果显示：Nrsod2缺失突变体孢子毒力显著降低。体表接种侵染时，突变体半致死时间较野生型显著延迟；体内注射侵染发现，Nrsod1和Nrsod2基因的敲除突变体的半致死时间（LT50）分别为为8.5d、10d，而野生型LT50为7d，Nrsod2突变体半致死时间较野生型显著延迟3d；14后，野生型侵染斜纹夜蛾幼虫全部死亡，Nrsod2突变体幼虫仍有30%的存活率。　　结论：通过构建敲除载体和农杆菌介导的遗传转化，我们成功获得到莱氏野村菌Nrsod1和Nrsod2基因的突变菌株。证明Nrsod1和Nrsod2基因在调控产孢、生长发育、应对逆境胁迫、两型转换、微菌核形成等过程中发挥不同程度的作用。qPCR研究基因表达证实，两个基因之间存在功能的冗余和相互影响，并能通过调控NOX复合体和CAT家族相关基因的活性进而影响MS的形成；Nrsod2影响了莱氏野村菌对斜纹夜蛾的毒力。