缺血性心脏病(又称冠心病,coronary artery disease, CAD)具有较高的发病率及致死率,是威胁人类健康的严重疾病之一。近年来其发病年龄逐渐有年轻化的趋势,因而引起了广泛的关注。越来越多的研究认为,心肌细胞凋亡是CAD发生发展过程中引起心肌细胞损伤进而死亡的重要原因。细胞凋亡主要由两条信号转导激活,即内源性通路(线粒体通路)和外源性通路(死亡受体通路)。内源性通路始于各种刺激因素导致线粒体膜通透性的改变,使促凋亡因子细胞色素C等释放至细胞浆而激活caspase-9。而在外源性通路中,当死亡受体与相应的配体结合后激活caspase-8。两条通路最终都通过激活caspase-3而导致细胞凋亡性死亡的特征性改变。氧化应激是这些心血管疾病病理过程中导致心肌细胞凋亡的重要因素。氧化应激是指部分还原形态的氧离子即活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的生成超过了细胞内源性解毒和/或使用能力的非稳态状态。活性氧在细胞内的异常聚集可导致重要生物大分子的损伤性氧化修饰,通过不同的信号转导通路引起细胞功能及结构的改变,最终导致细胞死亡。因此寻找有效的抗氧化剂对于抑制心肌细胞凋亡的发生及CAD的治疗具有重要的意义。冠心丹参方是由丹参、三七、降香三味药组成的,具有活血化瘀、行气止痛之功效,临床上主要用于心血管疾病的治疗。以往的研究显示,抗氧化作用是冠心丹参方发挥心血管保护作用的重要机制之一,但对方中有效成分抗氧化活性的系统分析及比较研究较少。因此,本研究采用体外心肌细胞培养,以H2O2造成氧化应激性损伤模型,分析冠心丹参方对H202诱导的氧化性心肌细胞损伤保护作用的物质基础,并进一步探讨其作用机制,为从现代分子生物学水平上阐明中药复方有效性及作用机理提供实验依据。本课题分为三个部分：第一部分冠心丹参方对H202诱导H9c2心肌细胞损伤的物质基础研究实验目的：观察冠心丹参方中主要活性成分对H202引起的H9c2心肌细胞损伤的影响。实验方法：冠心丹参方中不同浓度主要活性成分丹参中丹酚酸B及丹参酮ⅡA磺酸钠,三七中人参皂苷Rb1及三七皂苷R1,降香中黄酮类化合物木犀草素预孵育相应时间后,150μM H202作用6h。MTT法检测各活性成分对H9c2心肌细胞活力的影响。实验结果：除三七皂苷R1外,丹酚酸B、丹参酮ⅡA磺酸钠、人参皂苷Rb1以及木犀草素预孵育4h对H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤均具有不同程度的保护作用,其中以木犀草素的抗氧化性损伤作用最强。木犀草素在预孵育1h后即表现出显著的抗氧化性细胞损伤的作用。三七皂苷R1在预孵育24 h后对H202引起的细胞损伤具有保护作用。结论：在H202诱导H9c2心肌细胞损伤模型上,降香中黄酮类化合物抗氧化作用最显著,是冠心丹参方中发挥抗氧化活性的主要成分。冠心丹参方中的主要活性成分在不同时间点上发挥了作用,体现了其抗氧化作用在不同时间上的协同效应。第二部分黄酮类化合物对H202诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用研究及构效关系分析实验目的：观察黄酮类化合物对H202诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用。实验方法：黄酮类化合物的代表性苷元化合物：木犀草素,槲皮素,柚皮素,二氢槲皮素及儿茶素预孵育1h后,150μM H202作用6 h。黄酮糖苷化合物木犀草苷,黄岑苷,芦丁,杨梅苷,甘草苷和柚皮苷预孵育4h后,150μM H202作用6 h。MTT法检测各活性成分对H9c2心肌细胞活力的影响。实验结果：在对H202诱导的H9c2心肌细胞氧化性损伤的模型上,黄酮苷元按保护作用由强到弱依次为：槲皮素>木犀草素>儿茶素>二氢槲皮素>柚皮素,黄酮糖苷的保护作用由强到弱依次为：木犀草苷>芦丁>黄岑苷>杨梅苷>甘草苷和柚皮苷。结论：在所研究的黄酮苷元化合物中,黄酮醇类化合物槲皮素和黄酮类化合物木犀草素对H202诱导H9c2心肌细胞损伤保护作用较强,而黄酮糖苷类化合物中木犀草苷的保护作用较强。从结构上分析,羟基的数目、C环3位的羟基、C-2和C-3之间的双键以及C环4位上的羰基、糖基的存在均对其抗氧化活性具有不同程度的影响。第三部分黄酮类化合物木犀草苷对H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡的保护作用及机制研究实验目的：研究降香中黄酮类化合物木犀草苷对H202引起的H9c2心肌细胞凋亡的影响及探讨其可能的作用机制。实验方法：木犀草苷预处理H9c2细胞4 h后,150uM H202作用6 h。采用Hoechst33342荧光染色及TUNEL法进行细胞核形态学观察,Annexin V FITC/PI双染流式细胞术及Caspase蛋白酶活性分析木犀草苷对H202诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响。通过检测内源性抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活性,流式细胞术检测细胞内ROS水平及线粒体膜电位,Western blot分析凋亡相关蛋白表达的变化研究木犀草苷对氧化应激诱导心肌细胞凋亡的可能的作用机制。实验结果：H202严重损伤H9c2细胞并伴有显著的凋亡特征：细胞核形态改变如染色质浓缩、边集及Caspase-3的激活等。木犀草苷预处理可显著降低凋亡细胞的比例。木犀草苷可增强内源性抗氧化酶SOD, GSH-Px, CAT的活性,因而抑制细胞内活性氧自由基的生成。另外,木犀草苷预处理可显著抑制H202引起的Caspase酶活性的增加,抑制线粒体膜电位的下降,并增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低促凋亡蛋白bax的表达,从而抑制促凋亡因子(细胞色素C和smac)从线粒体的释放,稳定线粒体功能。线粒体ATP-敏感K+通道(mitoKATp)和Ca2+激活的K+通道(nitoKCa)开放的阻断剂可不同程度的减弱木犀草苷的心肌保护作用。进一步的研究显示,木犀草苷可抑制H202诱导的JNK及P53的表达的增加。结论：降香中的黄酮类化合物木犀草苷可通过增加抗氧化能力,维持线粒体功能及调节JNK和P53信号转导通路而对H202引起的H9c2细胞凋亡具有保护作用。