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PTEN是1997年克隆得到的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,定位于人染色体10q23.3。它与许多肿瘤的发生或发展有着密切关系,目前已在很多肿瘤中发现有PTEN的缺失与突变;而且,PTEN在细胞信号转导和正常胚胎发育过程中均有重要作用。PTEN蛋白由403个氨基酸残基组成,含有双专一性磷酸酶结构域;这种蛋白不仅具有蛋白磷酸酶活性,而且具有脂质磷酸酶活性;它既能使磷酸化的丝氨酸/苏氨酸残基脱磷酸,也能使磷酸酪氨酸脱磷酸,还能使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol(3,4,5)-trisphosphate,PIP3) 的3位脱磷酸。通过对PI3-K/Akt、 MAPK、FAK等重要的细胞内信号转导通路的调节,PTEN可以调控细胞生长、增殖、粘附与迁移,并能促进细胞凋亡。PTEN的功能主要是通过其磷酸酶的活性来实现的,为了研究PTEN磷酸酶活性与BEL-7404肝癌细胞生物学行为之间的关系,我们将含野生型或特定酶活性缺失突变型的PTEN的表达质粒转染到BEL-7404肝癌细胞中。实验发现,PTEN可以抑制7404肝癌细胞的生长与增殖,还可以抑制细胞的克隆形成与细胞迁移,并且影响了7404肝癌细胞的周期。进一步分析显示,PTEN的这些功能主要是通过PTEN蛋白质的磷酸酶活性来实现的。此外,我们采用Northern blot和Western blot等方法,研究了7株人肝癌细胞(HHCC)与L02细胞(肝永生化细胞株)中PTEN的mRNA表达水平和蛋白质表达水平,实验发现,与L02细胞相比,7株人肝癌细胞中PTEN的mRNA表达水平与蛋白质表达水平均下降,其中HepG2细胞株中的PTEN蛋白质几乎检测不到,而且PTEN蛋白质的变化趋势与PTEN mRNA的变化趋势基本一致,两者之间存在相关关系(p<0.01)。我们利用RT-PCR的方法克隆了8株细胞PTEN的编码框,序列分析的结果显示,在8株细胞的PTEN编码框中均未发现片段缺失或点突变,说明7株肝癌细胞中PTEN表达的差异不是由突变所致,提示PTEN表达的转录水平调控占有重要地位。为了探讨肝癌细胞中PTEN的转录调控机制,我们克隆了PTEN的全长启动子区域,通过构建启动子系列缺失的报告质粒,通过瞬时转染并结合报告基因活性测定方法,我们确定PTEN的核心启动子区定位在-1118到-778区域的341bp的片段内,而-1389到-778这个612bp片段区域是PTEN启动子的最高活性区。我们将PTEN启动子的最高活性区片段转染到8株细胞中,结果发现,PTEN启动子在8株细胞中的活性高低不一,且各株细胞间活性变化趋势与PTEN mRNA水平的变化趋势相<WP=5>一致,而且存在相关关系,进一步提示,肝癌细胞中PTEN表达的转录水平调控可能处于很重要的地位。启动子转录活性的调控是基因表达调控的主要方式。通常通过反式作用因子与启动子上的顺式作用元件结合,启动或调节基因的转录。生物学软件分析发现,PTEN启动子的核心区有10个潜在的转录因子结合位点,我们分别用8核苷酸序列替代每一转录因子结合位点,得到10 个单一转录因子结合位点突变的报告质粒(△pGl3-612),将上述报告质粒分别转染到SMMC-7721和L02细胞中,结果发现,MAZ 1、MAZ 2、p53和Sp1结合位点对于PTEN启动子表现最佳活性是必需的。将Sp1或MAZ的表达质粒分别与上述突变型或野生型启动子报告质粒,共转染上述2株细胞,结果发现Sp1和MAZ可以明显上调PTEN启动子的活性,此上调作用主要依赖于MAZ 1、MAZ 2结合位点。EMSA结果显示,以Sp1为标记探针形成的条带可以被公认的高亲和力的Sp1非标记探针竞争性抑制,也能够被非标记的MAZ探针竞争性抑制;以MAZ为标记探针形成的条带,可以被非标记的MAZ探针竞争性抑制,也能够被公认的高亲和力的Sp1非标记探针竞争性抑制, 提示Sp1和MAZ可以结合在相同的序列上。以上结果表明MAZ 1、MAZ 2位点参与Sp1与MAZ对PTEN启动子活性的调节。综上所述,我们得出结论,Sp1和MAZ可以通过与-1035到-1016区域的序列结合,上调PTEN基因的表达。