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白及(Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)假鳞茎发育过程对其药材产量和品质有重要的影响。假鳞茎发育,是外界环境因素和内部调控因子共同作用的结果。本研究以白及种子为材料,研究组培苗培育条件。以组培苗为材料,研究假鳞茎形成和发育过程中内源激素含量与差异表达基因。主要研究结果如下:1.白及种子萌发试验研究表明:以3/4MS作为基本培养基,白及种子萌发的总体结果优于MS和1/2MS。在3/4MS+0.7mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+土豆70g/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂组成的培养基上,种子萌发最快,20d时萌发率达到了74%,3/4MS+0.5mg/L6-BA+0.7mg/LNAA+0.3mg/LIAA+0.4mg/LKT培养基配方较适宜白及组培苗增殖;3/4MS+0.3mg/LNAA+0.1mg/LIAA+0.4mg/LKT培养基配方适宜白及植株的生长发育;适宜根系生长的激素浓度为1mg/L6-BA、0.3mg/LIAA和1.2mg/LKT。2.白及假鳞茎诱导研究表明,选择3/4MS作为基本培养基时,假鳞茎的诱导率优于MS和1/2MS。在3/4MS的基础上,添加0.5mg/L6-BA、0.3mg/LNAA较适宜白及组培苗的生长,且假鳞茎诱导率高;不同激素组合培养白及假鳞茎时,发现NAA和IAA对白及假鳞茎形成的影响一样的,其次6-BA和KT,3/4MS作为基本培养基,添加0.5mg/LNAA、0.3mg/LIAA和0.8mg/LKT能更好的诱导假鳞茎的形成,且时间相对较短,有益于假鳞茎新芽萌发数的增加、根数的增多及假鳞茎的生长和发育。3.白及组培苗质量等级的划分及科学性与合理性验证结果表明,白及组培苗质量分为3个等级,I级苗假鳞茎直径≥7mm,株高≥8cm;II级苗假鳞茎直径≥5.5mm,株高≥4cm;III级苗假鳞茎直径≥4mm,株高≥4cm。等级苗存活率结果表明,白及组培苗假鳞茎的直径和株高越大,移栽后白及植株存活率越高,即I级苗存活率>II级苗>III级苗存活率>等外苗;I级苗假鳞直茎总体平均增长值大于II级苗,微小于III级苗,但对于个别植株而言,其增长量远大于II和III级苗,假鳞茎出芽率和新芽萌发数也相对很高,新芽数一般的1-2个/株。4.白及假鳞茎形成和膨大时期划分结果表明,白及假鳞茎直径和鲜重生长发育的过程中呈S型曲线增长,根据假鳞茎直径和鲜重的S型曲线将白及组培苗假鳞茎的形成分为:形成期、迅速膨大期、膨大中期、分叉期和新芽形成期。LC-MS测定白及组培苗假鳞茎5个时期的内源激素(GA3、ABA、IAA和ZR)发现:假鳞茎直径和鲜重间呈极显著正相关,而不同激素间以及与假鳞茎性状间具有一定的相关性,但显著性不同。除假鳞茎直径和鲜重与内源ZR的相关性不显著以外,其他激素与假鳞茎的直径和鲜重相关性均达到显著或极显著水平,其中,假鳞茎直径和鲜重与内源激素IAA均呈极显著正相关。假鳞茎直径和鲜重分别与GA3呈极显著负相关和呈显著负相关。假鳞茎性状则与ABA呈极显著负相关。此外,假鳞茎直径和鲜重分别与GA3/ABA呈显著负相关和负相关不显著,直径和鲜重与IAA/ABA均呈极显著正相关,相关系数分别为0.86**、0.93**,假鳞茎直径和鲜重与(GA3+IAA)/ABA呈极显著正相关,表明假鳞茎形成和膨大过程中,内源IAA对假鳞茎的生长发育起着至关重要作用,属于正调控因子。5.白及组培苗假鳞茎转录组测序结果发现,组装获得51,277个Unigene,平均长度是941nt。GC含量42.7985%,N50数量是9277nt、长度为1605,最长unigene长度和最短unigene长度分别是13871nt、201nt,Unigene全部碱基数48281634。将51,277个Unigene注释到数据库NR、Swiss Prot、KEGG和COG/KOG中,分别获得25964、16502、24969、14063个Unigene。另外,有24600个(47.97%)Unigene未能在四大数据库中得到注释。将获得的unigenes进行GO、KEGG及KOG分析,GO功能注释的生物学功能(Molecular Function)、生物学进程(Biological Process)和细胞组件(Cellar Component)共分为51个功能亚类;共有5186条Unigene分配到133条KEGG代谢通路中,其中,与激素合成有关的代谢途径有植物激素信号传导途径(ko04075)、玉米素的生物合成(KO00908)、MAPK信号通路-植物(KO04016)、油菜素内酯的生物合成(KO00905),α-亚麻酸代谢(KO00592)、色氨酸的生物代谢(Ko00380);有14063条Unigene被注释到KOG中,分为25个种类。CDS预测结果表明,共计得到27560个CDS,其预测比为53.74%。SSR分析表明,共搜索到36种5955个SSR位点。转录因子编码能力预测共筛选到57个转录因子,基因家族共1204个TF基因,基因数量最多的转录因子是b HLH和C2H2两个家族。根据阈值选择出差异表达显著基因,结果表明,XCQ-VS-XSPDQ有206个差异表达显著的Unigene,包括115个上调基因(20个Unigene表达量相对较高),91个下调(42个表达量下降显著);XSPDQ-VS-PDZQ有555个,8个上调(7个Unigene表达量最大),547个下调(22个表达量显著降低);PDZQVS-FCQ有591个,包含62个上调(16个基因表达量相对较大),529个下调(19个Unigene表达量下降显著);FCQ-VS-XYXCQ有827个,586个上调(81个Unigene有较高的表达量),241个下调(35个Unigene表达量显著降低)。对GO和KO富集分析,每个比较组中富集显著差异表达基因最多的Pathway均是Metabolic pathways(ko01100),其次是Biosynthesis of secondary metabolites(ko01110)。激素信号转导途径与合成途径均有显著差异表达基因不同程度的富集,与之相关的内源激素有玉米素核苷、生长素、细胞分裂素、赤霉素、油菜素内酯、水杨酸、脱落酸、乙烯、茉莉酸和吲哚乙酸。综上所述,本试验研究结果将为白及组培苗分级与质量管理和组培苗驯化移栽提供技术支撑,将为白及假鳞茎发生发育机理研究奠定基础,为白及假鳞茎发育的人工调控技术研究提供理论和技术参考,对促进白及基础研究和栽培发展具有重要意义。